一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，设及一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方 法。
【背景技术】
[0002] 细菌展示技术又称W细胞内膜为基础的细胞间质表达技术（anchored periplasmaexpressiontechnology，APEx)。该技术特点是利用细胞间质膜脂蛋白的信号 肤NlpAleader将目的蛋白运送到细菌间质腔，而NlpAleader在蛋白质跨膜运输过程中 被逐步降解，剩下的6个氨基酸（CDQSS巧与细胞内膜外侧的磯脂层形成脂巧键，从而将与 其融合的抗体片段展示于细菌内膜外侧。当细菌外膜被溶菌酶消化后成原生质球，解育液 中的抗原可进入细菌间质与错定在细胞内膜外侧的抗体片段结合，然后将其与巧光标记的 抗体进行共解育，阳性克隆可被流式细胞仪高通量的检测分离。
[0003]pelBleader为果胶酶基因前导肤，可W引导与其融合的蛋白质进入细菌间质，并 且在进入间质后也被降解完全。其融合的蛋白质在间质腔中和牟定的具有结合能力的抗体 片段结合。
[0004] 细菌展示技术在筛选抗体方面具有很多优势如；（1)高富集比；（2)高阳性率；（3) 由于反应在溶液状态下进行，可克服常规生物淘洗过程中由于筛选配基固定化而导致的 "亲和效应"。应用流式细胞术（FCM)进行筛选可W真正的做到实时监测同步跟进，非常直观 的追踪抗原表位的甄别情况。此外，该技术相对简便易行，只要经过相应的酶切位点就可W 直接将抗体片段插入到展示载体中，并且经过细菌电转化可获得库容量高达1〇9~10W的 抗体库，满足了抗体筛选对库容量要求。
[0005] 全世界范围内，只有美国Texas大学于2007年在美国科学院院报上报道了展示 F油抗体库的展示技术APEx2-hybrid，所利用的宿主菌为E.coliDH10B，但是迄今为止尚 无文献验证该方法的可行性和实用性。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种获得特异于祀标抗原的目标单链抗体的编码基因 的方法。
[0007] 本发明所提供的获得特异于祀标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，具体可 包括如下步骤：
[0008]A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编 码库：
[0009] (al)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并引 物对1，W及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2 ;
[0010] 所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述祀标抗原的微生物的宿主的抗体 框架区序列；如所述祀标抗原为能够感染人的己肝病毒的某一蛋白，则所述已知的抗体框 架区序列为人的抗体框架区序列；
[0011] (a。采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体重 链可变区集合和抗体轻链可变区集合；
[0012] 所述初始样本中含有由不同种抗所述祀标抗原的抗体组成的抗体库；
[0013] 所述初始样本可为如下a)或b):
[0014] a)健康个体的组织样本（如血液等），所述健康个体为免疫了含有所述祀标抗原 或其编码核酸的疫苗后，激起免疫反应产生相应抗体的健康个体；
[0015] b)患病个体的组织样品（如血液等），所述患病个体为因携带所述祀标抗原的致 病微生物（如病毒、细菌或真菌等）感染所引起的患病个体，且经证实已激起免疫反应并产 生抗体。
[0016] 所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合 为由不同轻链可变区组成的集合；
[0017] 所述简并引物对1和所述简并引物对2均既可为一个引物对，也可为多个引物 对。当为多个引物对时，采用所述简并引物对1中的每个引物对分别对所述初始样本进行 扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体重链可变区集合；采用所述简并引物对2中的每 个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体轻链可变区集 合。
[0018] (a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集 合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗体编 码基因组成的基因编码库；
[0019] 所述重链恒定区CH1为源自于携带所述祀标抗原的微生物的宿主的重链恒定区 CH1的前15个氨基酸；如所述祀标抗原为能够感染人的己肝病毒的某一蛋白，则所述重链 恒定区CH1为人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；
[0020] 在本发明中，所述抗体重链可变区连接于所述重链恒定区CH1的上游；所述抗体 轻链可变区连接于所述重链恒定区CH1的下游。
[0021] B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述祀标抗原的所述目标单链抗体的基 因编码序列：
[0022] 化1)将所述基因编码库中的各待检测单链抗体编码基因分别与祀标抗原-标签 蛋白融合基因共同构建于同一表达载体，并使所述待检测单链抗体编码基因融合于信号肤 1的编码基因的下游，使所述祀标抗原-标签蛋白融合基因融合于信号肤2的编码基因的下 游，获得重组表达载体库；所述重组表达载体库中各载体上均含有所述祀标抗原-标签蛋 白融合基因和任一种所述待检测单链抗体编码基因；
[0023] 所述祀标抗原-标签蛋白融合基因为由所述祀标抗原的编码基因和所述标签蛋 白的编码基因融合而成的融合基因；
[0024] 所述信号肤1为具有如下功能的信号肤；将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜 外侧（即将所述与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔，并定位于细菌内膜外侧）；
[0025] 所述信号肤2为具有如下功能的信号肤；将与其融合的目的蛋白运送到细菌间质 腔后自身完全降解，所述目的蛋白游离于所述细菌间质腔内；
[0026] 所述信号肤1不具有所述信号肤2的W上功能；且所述信号肤2也不具有所述信 号肤1的w上功能。
[0027] 化2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌 库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体（即在所述重组细菌 库中，每个所述重组细菌中均只含有一种所述重组表达载体，该一种重组表达载体可为所 述重组表达载体库中的任一种所述重组表达载体）；
[0028] 化3)培养所述重组细菌库，诱导所述重组表达载体进行表达，由所述待检测单 链抗体编码基因编码所得的待检测单链抗体被展示于所述细菌内膜外侧，由所述祀标抗 原-标签蛋白融合基因编码所得的祀标抗原-标签融合蛋白游离于所述细菌间质腔内；
[0029] 化4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜（如用溶菌酶处理），得到原生质 球库；所述原生质球库中每个原生质球上均展示有任一种所述待检测单链抗体，游离于所 述原生质球外的所述祀标抗原-标签融合蛋白能够被所述待检测单链抗体中的特异性单 链抗体所捕获，形成抗原抗体复合物（而所述原生质球表面的非特异性单链抗体则不能捕 获所述祀标抗原）；
[0030] 化5)将所述原生质球库与经巧光标记的抗所述标签蛋白的抗体共同解育，只有表 面形成了所述抗原抗体复合物的原生质球能够被标记上所述巧光，从所述原生质球库中获 得表面被标记上了所述巧光的原生质球（如采用流式细胞仪对所述原生质球库进行流式 分选），记为巧光-原生质球；所述巧光-原生质球的表面展示的所述待检测单链抗体即为 所述目标单链抗体；
[0031] 化6)从所述巧光-原生质球中提取质粒，再次转入所述宿主细菌，进行所述质粒 的扩繁培养，从培养后的细菌中提取所述质粒，保种；
[0032] 对所述质粒测序后获得所述目标单链抗体的基因编码序列。
[0033] 本发明还提供了一种获得特异于祀标抗原的目标单链抗体的方法，是构建单链抗 体库并从中筛选单链抗体的方法。
[0034] 该方法除了包括所述A)步骤和所述B)步骤，在所述B)步骤之后还包括如下步骤 C)；
[003引 C)根据步骤B)获得的所述目标单链抗体的基因编码序列，进行蛋白表达，获得所 述目标单链抗体。
[0036] 在本发明中，所述信号肤1为NlpAleader信号肤；所述信号肤2为pelBleader 信号肤。
[0037] 所述NlpAleader信号肤的编码基因的序列为序列表中序列1的第5258-5344位； 所述pelBleader信号肤的编码基因的序列为序列表中序列1的第167-232位。
[0038] 在本发明中，所述宿主细菌为大肠杆菌；具体为大肠杆菌D册a。
[0039] 在本发明中，所述标签蛋白为Flag蛋白。所述Flag蛋白的氨基酸序列具体为序 列表中序列2所示。
[0040] 在本发明中，所述巧光的标记物为FITC。
[0041] 在本发明中，步骤化1)中，所述表达载体具体为地GD载体；所述地GD载体的序列 具体如序列表中序列1所示。
[0042] 在所述方法的步骤化5)中，所述"从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述 巧光的原生质球"中，所述"获得"的方法即可为单轮筛选，也可为多轮（如2-4轮）筛选； 当为多轮筛选时，自第2轮筛选起，每一轮筛选均从前一轮筛选所得的所述原生质球中提 取质粒，再次转入所述宿主细菌，重复化3)-化5)的步骤。随着筛选轮数的增加可W逐渐降 低经所述巧光标记的抗所述标签蛋白的抗体（如FITC标记的Flag抗体）的用量，该样有 利于筛选到亲和力更强的抗体。
[0043] 本发明的另一个目的是提供一种用于获得特异于祀标抗原的目标单链抗体或其 编码基因的试剂盒。
[0044] 本发明所提供的用于获得特异于祀标抗原的目标单链抗体或其编码基因的试剂 盒，可包括表达载体、宿主细菌、经巧光标记的抗标签蛋白的抗体；
[0045] 所述表达载体含有编码所述信号肤1和所述信号肤2的基因，用于共表达所述待 检测单链抗体和所述祀标抗原-标签融合蛋白（如所述地GD载体）；
[0046] 所述宿主细菌可为大肠杆菌；具体如大肠杆菌D册a;
[0047] 所述经巧光标记的抗标签蛋白的抗体可为经FITC标记的抗Flag蛋白的抗体。
[0048] 另外，所述试剂盒中还可含有记载有如上所述方法的可读性载体，如说明书。
[0049] 所述试剂盒在获得特异于祀标抗原的目标单链抗体或其编码基因中的应用也属 于本发明的保护范围。
[0050] 在本发明中，所述祀标抗原为源自病原微生物（如病毒、细菌或真菌）的具有抗原 活性的物质，如蛋白、多肤、多糖或小分子化合物和载体蛋白的偶联物等。
[0051] 在本发明的一个实施例中，所述祀标抗原具体为传染性法氏囊病病毒（IBDV)的 VP2蛋白。所述VP2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4,所述VP2蛋白的编码基因的序列 为序列表中序列5。所述重链恒定区CH1为鸡的重链恒定区CH1的前15个氨基酸。所述鸡 的重链恒定区CH1的氨基酸序列为序列表中序列6的第125-139位（对应的编码基因序列 为序列表中序列7的第373-417位）。所述