仅解决 了传统上从Leber病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区 传递样本的问题，血滤纸片、毛发W及口腔粘膜刮片（棉拭子）或唾液斑滤纸片等可W很容 易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。
[0015] 2.目前国内外有几种线粒体相关的母系遗传性疾病基因诊断方法，如直接测序 法巧光定量PCR检测方法、基因巧片检测方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁 琐W及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与该些方法相比较，PCR-酶切技术则结合了 特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反 应管中进行特异性PCR扩增，通过一次PCR-酶切便可在几小时内同时检出mtDNAT3394C 突变。另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计。首先，正常和突变等位基因 间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同，因而大大提高了酶切 的特异性；另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而 避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例W及对 PCR反应条件进行优化，W确保结果的特异性和稳定性。
[001引 3.应用本发明提供的试剂盒进行mtDNAT3394C突变检测，成本较其他检测方法 更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一 般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行Leber病相关的 mtDNAT3394C突变的大规模筛查和预防性检查。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明的特异性巢式PCR引物示意图。
[0018] 图2是本发明的特异性巢式PCR扩增方案示意图。
[0019] 图3是携带T3394C突变Leber病家系系谱图。
[0020] 图4是基因特异性巢式PCR扩增鉴定mtDNAT3394C的7%聚丙締酷胺凝胶电泳图。 [00川符号说明： 图1和2中；F外为特异性巢式PCR第一次扩增的正向引物；R外为特异性巢式PCR第 一次扩增的反向引物，与F外配对使用；F内为特异性巢式PCR第二次扩增的正向引物，R内 为特异性巢式PCR第二次扩增的反向引物，与F内配对使用；T3394C表示为线粒体DNA第 3394位，野生型为T，发生基因突变后为C。
[0022] 图3中：□为正常男性个体；0为正常女性个体；为发病男性个体；?为发病 女性个体；，为先证者；I为该家系的第一代成员；II为该家系的第二代成员；III为该家系 的第=代成员。
[002引图4中；E1表示经过PCR扩增产物未酶切的电泳图；E2为正常阳性对照；E3先 证者的父亲（II-1) ;E4为先证者的外祖父（I-1) ;E5表示先证者携带T3394C突变位点检 测的PCR扩增产物酶切鉴定的电泳图(III-2);E6为先证者的姐姐(III-1);E7为阴性对照， E8为对照mark标记条带。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，W使本领域的技术人员可W 更好的理解本发明并能予W实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[00巧]实施例1本发明一种试剂盒 本发明提供的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T3394C片段的PCR混合液、针对T3394C设计的一对外引物、针对T3394C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照组 成。其中，DM提取混合液主要由细胞裂解液和蛋白酶K、氯仿、苯酪、无水酒精组成；扩增 T3394C片段的PCR混合液包括dNTP(脱氧单核巧酸）、10XPCR缓冲液、MgCl2、S蒸水和 酶值NA聚合酶），针对T3394C设计的一对外引物有外前向引物F:TACTTCACAAAGCGC CTTCC(SEQIDN0:1)，外反向引物R:ATGAAGAATAGGGCGAAGGG(SEQIDNO:。；针 对T3394C设计的内引物包括内前向引物F:GCAGAGCCCGGTAATCGCATA(SEQIDN0:3)，内反 向引物R:GCGAAGGGTTGTAGTAGCCCGTAGGGGCCTACAACGTTGGGGCCTTTGCGTAGTTGTAGCT(SEQ IDN0:4);限制性内切酶为限制性内切酶MeI;阳性对照是含有线粒体序列第3394位点 能够发生酶切样本；阴性对照是线粒体序列第3394位点不发生酶切样本。
[0026] 在上述试剂盒中，在扩增T3394C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的 少许二甲基亚讽（0.1-0.2y1为宜)。
[0027] 实施例2携带线粒体ND1T3394C突变的Leber病家系的检测 1.检测样本 选择1个携带T3394C突变的Leber病家系。其家系图参见图3。该个家系呈现典型的 母系遗传，发病者均W视力下降为唯一的临床症状，但是家系中每个发病成员的视力损伤 程度不等。该个家系总人数为14人，其中母系成员数为9人，患Leber病者有5人。
[002引 2.基因组DNA的提取 分别获取5名受检者的样本(包括采集III-1和III-2的毛细血管一滴静脉血滤纸片；II-1、II-2为口腔粘膜刮片或唾液；I-1为带毛囊的头发)，将血滤纸片用干净的剪刀剪 成大小约lcm2的碎纸片放入1. 5mlEP管（Eppendo计管)，加入900y1红细胞裂解缓冲液 (20mmol/LTris-HCl，pH7.6)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000巧m离屯、Imin，收 集白细胞沉淀；收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0. 1ml唾液直接吐进EP 管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾 液样本的EP管中，反复吹打后，12000巧m离屯、5min，除去上清，重复该过程一次；⑨用棉拭 子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的綴子小屯、撕去其外表面，放入EP管 中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm2碎纸 片置于EP管中；带毛囊的头发样本用70%己醇洗带毛囊的毛发1次，后再用蒸馈水冲洗毛 发2次。在1.5mlEP管中分别放入2~4根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去 毛发高于EP管的部分。然后加入600y1细胞裂解液，混匀后再加入溶液I，使得蛋白酶K 的工作浓度为20yg/ml。充分混匀后55°C消化裂解，接着W盐析法去除蛋白等杂质，异丙 醇沉淀DM,最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20°C保存备用。
[002引3.引物设计 使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件协助设计改良引物，根据已公开的人类线粒体 基因剑桥参考序列（SEQIDN0:5)进行设计，引物的设计方案(见图1)如下： 针对mtDNA3394位点，保证引物设计的特异性，我们设计巢式PCR两对引物F外/R外，F内/R内；它们长度、退火温度相近便于实验条件稳定，W增强特异性。由此设计出的4263 位点的巢式PCR引物包括外前向引物F:TACTTCACAMGCGCCTTCC(SEQIDN0:1)，外 反向引物R:ATGAAGAATAGGGCGAAGGG(SEQIDN0:2);针对T3394C设计的内引物包 括内前向引物F:GCAGAGCCCGGTAATCGCATA(SEQIDNO: 3)，内反向引物R:GCGAAGGGTTGTA GTAGCCCGTAGGGGCCTACAACGTTGGGGCCTTTGCGTAGTTGTAGCT(SEQIDN0:4)0
[0030] 4.基因特异性巢式PCR扩增 根据上述设计的4条引物序列，通过人工合成(委托生物公司)获得2对引物，W上述提 取的被检样本基因组DNA为模板，进行基因特异性巢式PCR扩增和7%的聚丙締酷胺凝胶电 泳酶切鉴定(见图2)。
[0031]
【主权项】
1. 一种检测Leber病线粒体T3394C试剂盒，其特征在于，由DNA提取混合液、扩增T3394C片段的PCR混合液、针对T3394C设计的一对外引物、针对T3394C设计的一对内引 物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照组成，其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解 液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T3394C片段的PCR混合液试剂包括dNTP、 IOXPCR缓冲液、MgC12、三蒸水和Taq酶，针对T3394C设计的一对外引物是外前向引物F: TACTTCACAMGCGCCTTCC(SEQIDNO: 1)，外反向引物R:ATGMGMTAGGGCGMGGG (SEQIDN0:2);针对T3394C设计的一对内引物是内前向引物F:GCAGAGCCCGGTAATCGCATA (SEQIDN0:3)，内反向引物R:GCGAAGGGTTGTAGTAGCCCGTAGGGGCCTACAACGITGGGGCCTTT GCGTAGTTGTAGCT(SEQIDN0:4);限制性内切酶是限制性内切酶船eI;阳性对照是含有 线粒体序列第3394位点能够发生酶切样本；阴性对照是线粒体序列第3394位点不发生酶 切样本。
2. 在上述试剂盒中，在扩增T3394C的PCR混合液中添加0. 1-0. 2y1二甲基亚砜。
3. 权利要求1所述试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体基因MVT3394C突变中的应 用。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) 基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、 口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA; (2) 特异性PCR扩增：使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件根据SEQIDNO: 5所示 的人类线粒体基因序列所设计的引物F# /%h、F@ /Rft是能扩增出包含上述Leber病的线粒 体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸3150-3980,其序列为序列表中 的SEQIDNO: 1、2;F内/R内扩增出为线粒体DNA的核苷酸3239-3455,其序列为序列表中 的SEQIDN0:3、4 ; (3) 酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶船eI对T3394C突变位点处进行酶 切； (4) 突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量 及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T3394C突变。
【专利摘要】本发明提供一种快速、简便、准确、经济的检测Leber病相关的线粒体DNA T3394C突变的试剂盒。由DNA提取混合液、扩增T3394C片段的PCR混合液、一对外引物、一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照组成。本发明从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA，既解决传统上从原发性Leber氏病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦，又解决了跨地区传递样本的问题，提高酶切特异性，避免出现假阴性，提高检测结果的稳定性。本发明是一种快速、简便、准确、经济的检测试剂盒，可实行Leber病相关的mtDNA T3394C突变的大规模筛查和预防性检查。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104774926
【申请号】CN201510116090
【发明人】管敏鑫, 蒋萍萍, 冀延春, 梁敏, 张娟娟
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月17日