用于体细胞核重编程的先天免疫激活的制作方法
【专利说明】用于体细胞核重编程的先天免疫激活
[0001]政府权利
[0002]本发明是在政府支持下根据国家卫生研宄所授予的合同HL100397和HL103400完成的。政府对本发明享有某些权利。
[0003]发明背景
[0004]Yamanaka和同事进行的开创性研宄显示某些转录因子的异位表达可能会诱导体细胞的多能性。这些诱导性多能干细胞(iPSC)自我更新并且分化成多种细胞类型，从而使其成为用于疾病和患者特定性再生医学疗法的一种有吸引力的选择。它们已被用于成功地模型化人类疾病并且具有极大的用于药物筛选和患者特定性细胞疗法的潜能。此外，从患病细胞产生的iPSC可充当适用于研宄疾病机制和潜在疗法的工具。然而，仍应对有关体细胞重编程为iPSC的潜在机制有更多了解，并且要关注在没有机制性深入理解的情况下的潜在临床应用。
[0005]用于重编程为多能细胞的因子(RF)组包括0ct3/4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28和Nanog。0ct3/4和Sox2是在胚胎干(ES)细胞中保持多能性的转录因子，而Klf4和c-Myc被认为是提高iPSC产生效率的转录因子。据信转录因子c-Myc修饰染色质结构以允许0ct3/4和Sox2较有效地接近为重编程所必需的基因，而Klf4通过0ct3/4和Sox2增强某些基因的激活。Nanog(像0ct3/4和Sox2 —样)是在ES细胞中保持多能性的转录因子，而Lin28是被认为影响在分化期间特异性mRNA的转译或稳定性的mRNA结合蛋白。最近，已证实0ct3/4和Sox2的逆转录病毒表达与丙戊酸、染色质去稳定剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的共施用一起足以使成纤维细胞重编程为iPSC。
[0006]为从体细胞产生iPSC，已使用病毒载体或质粒来过表达这些重编程因子的一些组合。然而，这些方法产生低重编程效率并且未能提供对重编程过程的精确控制。此外，这些用于核重编程的方法固有地引起关于由DNA整合所引起的潜在致瘤性和基因沉默突变的担忧。因逆转录病毒感染造成的外来DNA整合到宿主基因组中引起对外来DNA可使必需基因沉默或诱导这些基因调节异常的担忧。虽然Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子途径已用于在基因递送之后从宿主基因组上去除外来DNA，但没有一种策略消除诱变的危险，因为其留下小的残余外来DNA插入物。
[0007]作为基因修饰的替代方案，已产生用于无整合核重编程的细胞穿透蛋白(CPP)，其中重编程因子融合到为蛋白质膜运输到核中而提供的结构域中。已通过使用纯化重组蛋白在鼠胚胎成纤维细胞中实现成功重编程为多能细胞。尽管已使用来自胚胎干细胞(ESC)以及过表达四种转录因子的HEK293细胞的细胞提取物重编程人类细胞，但尚未使用纯化CPP重编程人类细胞。并且甚至在小鼠细胞情况下，使用CPP的重编程效率(约0.001%)比使用逆转录病毒载体实现的重编程效率(0.1% -1% )低大于10倍。
[0008]用于iPSC产生或转分化成不同体细胞类型的基于CPP和/或小分子的途径避免了关于外来DNA整合的所有担忧，并且提供对浓度、时间和因子刺激顺序的较大控制，然而此类方法在实际操作中仍存在重大问题。本发明解决了这个问题。
[0009]发明概述
[0010]提供用于使用非整合方法有效产生诱导性多能细胞或转分化细胞的组合物和方法。在本发明的方法中，需要重编程为多能细胞或转分化的体细胞与有效剂量的toll样受体(TLR)激动剂接触，所述TLR包括但不限于TLR3。接触步骤可在细胞与非整合重编程因子接触之前、与其同时或在其之后进行，通常同时进行。非整合重编程因子是核作用多肽或改变转录的小分子，并且其可诱导靶细胞重编程。在一些实施方案中，重编程因子是融合到多肽穿透结构域中的多肽，例如如本领域中已知的九精氨酸、tat等。在一些实施方案中，重编程因子是0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog中的一者或多者。
[0011]在一些实施方案中，提供重编程细胞群，其中初始体细胞群重编程为诱导性多能或转分化细胞群。此类细胞在本领域中已知的各种方法(包括药物筛选、自体或异体移植治疗性细胞施用等)中获得应用。重编程细胞群因不存在整合遗传因子而提供优势。
[0012]在其它实施方案中，提供用于体细胞核重编程的试剂盒。此类试剂盒可包含先天免疫激活剂，例如一种或多种TLR激动剂，包括但不限于双链核酸，诸如聚1:C。此类试剂盒可进一步包含用于多能细胞的非整合诱导的试剂，例如一种细胞穿透蛋白(例如S0X2、0CT4、Nanog、KLF4、cMYC等)或其混合物。此类试剂盒可作为另外一种选择或以组合形式提供一种适用于将细胞转分化为所关注谱系的因子或其混合物。举例来说，内皮细胞转分化试剂盒可包含BMP4、VEGF, bFGF、8_Br_cAMP、SB431542等中的一者或多者。此类试剂盒可进一步包含为进行本发明方法所必需的适合的缓冲剂、细胞生长培养基、说明书等。
[0013]还提供用于体内使用本发明方法的试剂盒和方法，其中治疗剂包含先天免疫激活剂，并且体内施用一种或多种细胞穿透肽和/或小分子用于治疗性调节细胞和/或组织表型。
[0014]附图简述
[0015]图1:由病毒载体表达或以细胞穿透肽形式递送的重编程因子诱导的基因表达的不同模式:(A)经逆转录病毒表达载体(红线)或细胞穿透肽(蓝线)感染之后Nanog的倍数表达。与病毒载体pMX-Sox2相比，细胞穿透CPP-S0X2引起下游目标和多能性基因的迟延表达。基因表达的相对倍数变化是在每天用200nM CPPS0X2处理之后或在第O天单一pMXSox2感染之后测定。所有数据以平均值土标准偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。(B)因为各处理条件下所选基因(Jarid2、Zic2、bMyb、0ct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似，所以其随时间推移的倍数表达的变化以所有六种基因的平均倍数增加显示。注意到与Sox2以CPP形式存在时相比，当Sox2以病毒载体形式存在时，目标基因表达快速增加。(C)与病毒载体pMX0ct4相比，细胞穿透CPP0CT4引起下游目标和多能性基因的迟延表达。Nanog基因表达是此不同基因时间表达模式的代表。基因表达的相对倍数变化是在每天用200nM CPP0CT4处理之后或在第O天单一 pM0ct4感染之后测定。所有数据以平均值土标准偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005o (D)显示各条件下所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和0ct4)随时间推移的平均倍数变化的概括图。注意到与0ct4以CPP形式存在时相比，当0ct4以病毒载体形式存在时，目标基因表达快速增加。
[0016]图2:不相关逆转录病毒载体促进CPP诱导的基因表达:(A)在pMX-Sox2 (红线)、CPP-S0X2 (蓝线)或pMX-GFP+CPP-S0X2 (绿线)处理之后，Nanog基因表达水平的相对倍数变化。(B)显示各条件下所选基因(即Jarid2、Zic2、bMyb、0ct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。当Sox2以CPP形式提供时，下游目标基因的激活延迟。然而，在不相关逆转录病毒载体存在下，目标基因表达快速增加，并且与pMX-Sox2相似。(C)在pMX-0ct4、CPP-0CT4或pMX_GFP+CPP_0CT4处理之后Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(D)显示各条件下所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和0ct4)随时间推移的平均倍数变化的概括图。所有数据以平均值土标准偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。
[0017]图3:TLR3途径的基因敲低抑制编码0ct4的逆转录病毒载体的作用:(A)在用TRIF-抑制肽(肽抑制剂-TRIF)处理的成纤维细胞中，在逆转录病毒-0ct4(pMX-0ct4)感染之后，0ct4的基因表达降低。下方图显示在四种条件下，所选多能基因(0ct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纤维细胞中，在逆转录病毒-0ct4(pMX-0ct4)感染之后0ct4的基因表达降低。下方图显示在四种条件下，所选多能基因(0ct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。(C)在TLR3shRNA-基因敲低成纤维细胞中，在逆转录病毒_0ct4 (pMX_0ct4)感染之后0ct4的基因表达降低。下方图(D-F)显示在四种条件下，所选多能基因(0ct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。所有数据以平均值土标准偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。
[0018]图4:TLR3_TRIF基因敲低成纤维细胞展现削弱的核重编程:(Α)用于使用以逆转录病毒载体形式递送的重编程因子产生iPSC的方案。(B)在错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞的逆转录病毒核重编程起始之后第30天iPSC的代表性图像。在TLR3信号传导途径的元件被基因敲低的成纤维细胞(即TRIF shRNA或TLR3shRNA细胞系)中，人类iPSC集落的发展显著延迟。相比之下，在所有其它TLR的衔接子被基因敲低的成纤维细胞(MyD88shRNA)中，或在用错义shRNA处理的成纤维细胞中，未注意到hiPSC发展延迟。(C)在由通过逆转录病毒转染递送的重编程因子转导的错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞系中，第35天hiPSC集落的总数目。hiPSC集落的产量因TLR3信号传导途径的基因敲低元件而降低。*P〈0.05 ;错义细胞与TRIF或TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞相比较。(D)第35天在错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞中，0ct4基因表达的倍数变化。
[0019]图5:聚1: C促进CPP诱导的目标基因表达:(A)在pMX_Sox2 (红线)、CPP_S0X2 (蓝线)或聚1:C+CPPS0X2(绿线)处理之后Jarid2的基因表达水平的相对倍数变化。(B)这些所选基因(即Jarid2、Zic2、bMyb, 0ct4、Sox2和Nanog)在各处理之后展现平均基因时间表达模式的概括图。聚1:C使CPPS0X2对下游基因的表达显著增强。(C)在pMX-0ct4、CPP0CT4或聚1:C+CPP0CT4处理之后Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(D)这些所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog, Sox2和0ct4)在各处理之后展现基因时间表达模式的概括图。聚1:C使CPP0ct4对下游基因的表达显著增强。所有数据以平均值土标准偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。
[0020]图6.TLR3激活使强力霉素诱导型系统中的重编程增强:(A)在暴露于强力霉素4周后，显示从表达编码四种重编程因子的dox诱导型多顺反子转基因构筑体的MEF衍生的iPSC集落的SSEA-1活染。在一些孔中，MEF还暴露于编码GFP的逆转录病毒构筑体或聚I:C? (B)显示第2周和第3周原始培养板中的SSEA-1+集落的直方图。聚1:C或编码GFP的逆转录病毒构筑体的共施用使强力霉素诱导的重编程的产量显著增加。(C)聚1:C或编码GFP的逆转录病毒构筑体的共施用促进0ct4和Sox2的基因表达。
[0021]图7.TLR3激活刺激CPP诱导的人类成纤维细胞重编程:(A)用于使用四种CPP-TF(0CT4-Rll、S0X2-Rll、KLF4-Rll*cMYC-Rll)产生人类 iPSC 的方案。(B)在第 30-45天，聚1:C的共施用使0ct4的基因表达增加。(C)在第30天和第40天，在存在和不存在聚1:C的情况下数到的TRA-1-81阳性集落。聚1:C的共施用使CPP诱导的重编程的产量显著增加。(D)CPP诱导的反式激活在第32天的ES样集落形成(10倍)
[0022]图8.由从病毒载体表达或以细胞穿透肽形式递送的个别重编程因子诱导的下游基因表达模式的差异:(A)显示与媒介物相比，在逆转录病毒或CPP-S0X2处理之后，所选多能基因(Sox2、0ct4、Nanog)和 Sox2 相关基因(Jarid2、Zic2、bMyb)随时间推移(第 0_6天)的表达强度的热图。媒介物或不相关逆转录病毒构筑体(pMX-GFP)对基因表达无影响。逆转录病毒Sox2使得六种基因中每一者的表达早期增加随后降低。CPP-S0X2使得基因表达增加延迟。(B)显示所选多能基因(Sox2、0ct4、Nanog)和0ct4相关基因(Tcf4、GAP43)随时间推移(第0-6天)的表达强度的热图。
[0023]图9.不相关逆转录病毒载体促进CPP诱导的基因表达:(A-B)在pMX_Sox2 (红线)、CPP-S0X2 (蓝线)或pMX-GFP+CPP-S0X2 (绿线)处理之后，Jarid2和Zic2的基因表达水平的相对倍数变化。(C)显示在各条件下所选基因随时间推移的平均倍数变化的概括图。(D-E)在 pMX-0ct4、CPP-0CT4 或 pMX-GFP+CPP_0CT4 处理之后，Tcf4 和 GAP43 的基因表达水平的相对倍数变化。
[0024]图10.非整合pMX-GFP促进CPP-0CT4诱导的基因表达:(A)经pMX_GFP突变体(上)或pMX-GFP wt (下)感染的BJ成纤维细胞的免疫荧光图像。(B-E)在pMX-GFP (红线)，pMX-GFP+CPP-0CT4 (蓝线)，pMX-GFP 突变体(绿线)或 pMX-GFP 突变体 +CPP-0CT4 (紫线)处理之后，0ct4、Sox2、Nanog和TLR3的基因表达水平的相对倍数变化。
[0025]图11.逆转录病毒GFP/0CT4/S0X2感染刺激先天免疫。在pMX_0ct4、pMX_Sox2、pMX-GFP、pMX-GFP+CPP-0CT4、pMX_GFP+CPP_S0X2、CPP-0CT4 或 CPP-S0X2 之后，先天免疫相关基因STAT1、STAT2、IFN β、NF- κ B、TLR3和TLR4的基因表达水平的相对倍数变化。
[0026]图12.TLR3信号传导的基因敲低使多能基因表达降低(与图3相关):㈧在用TRIF-抑制肽(肽抑制剂-TRIF)处理的成纤维细胞中，在逆转录病毒-0ct4(pMX-0ct4)感染之后，Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表达降低。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-0ct4感染之后，Tcf4、NF-KB或TLR3的基因表达降低。(C)在TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-0ct4感染之后，Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表达降低。
[0027]图13.MyD88的抑制不影响pMX_0ct4诱导的基因表达:(A)在用MyD88_抑制肽(肽抑制剂_MyD88)处理的成纤维细胞中，在逆转录病毒_0ct4 (pMX-0ct4)感染之后，0ct4、Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表达保持不变。(B)在MyD88 shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-0ct4感染之后，0ct4、Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表达保持不变。
[0028]图14.聚1:C使先天免疫基因的表达增强。在聚1:C、聚1:C+CPP-0CT4或聚1: C+CPP-S0X2 之后，先天免疫相关基因 STAT1、STAT2、IFN β、NF_k B、TLR3 和 TLR4 的基因表达水平的相对倍数变化。
[0029]图15.聚1: C通过TLR3使CPP诱导的基因表达增强:(A-B)在pMX_Sox2 (红线)、CPP-S0X2 (蓝线)或聚1:C+CPP-S0X2 (绿线)处理之后，Zic2和Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(C)显示在各条件下所选基因随时间推移的平均倍数变化的概括图。(D、E)在pMX-0ct4、CPP0CT4或聚1: C+CPP-0CT4处理之后，Tcf4和GAP43的基因表达水平的相对倍数变化。
[0030]图16.在强力霉素诱导的次级MEF系统中的重编程。强力霉素处理的MEF的形态变化。聚1:c以及pMX-GFP促进在第3天孔中聚集小而紧密的圆形细胞的变化。用pMX-GFP感染促进集落形成，因为在病毒粒子感染组中第7天观察到许多小集落。在第14天，典型mES样集落出现，其中许多具有激活的SSEA-1。
[0031]图17.聚1:C/病毒粒子早期促进表观遗传修饰(第2天):(A)用于评估在暴露于各种处理条件第2天0ct4启动子的H3K4me3的芯片分析。用pMX-GFP或用聚1:C刺激TLR3没有效果，CPP-S0X2也没有效果。然而，与pMX-GFP或与聚1: C组合，细胞穿透肽CPP-S0X2与逆转录病毒Sox2 (pMX-Sox2)的效果相似。(B)用于评估在暴露于各种处理条件的第2天