植物中内源基因的转录基因沉默的制作方法
【专利说明】植物中内源基因的转录基因沉默
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请涉及并要求2012年9月7日提交的美国临时专利申请系列号61/698, 203 的优先权。该申请援引加入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2312130PCTSequenceListing. txt，2013年8月26日创建，并且大小为14kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本 文。
【背景技术】
[0005] 本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默（TGS)。更具体 地，本发明涉及能够进行植物、植物组织和植物细胞中内源基因的TGS的核酸构建体。本发 明进一步涉及利用本发明的核酸构建体通过TGS减少植物、植物组织或植物细胞中的内源 基因表达的方法。
[0006] 本文中用来说明本发明的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其他材料 援引加入本文，并且为了方便，分别分组在参考文献中。
[0007] 超过十年前，Matzke和同事报道了植物中转基因启动子（N0S)的转录基因沉默 (TGS)和启动子DNA上的甲基化之间的关系（Matzke et al.，1989)。从那时开始，对于单 子叶植物和双子叶植物中的转基因和内源基因，已广泛研宄引起植物中TGS的机制（综述 参见（Matzke and Matzke, 2004 ;Eamens et al.，2008 ;Matzke et al.，2009)。目前 TGS 的观点提示通过双链RNA加工机器（AG04、DCL3)产生的21-24nt小RNA(sRNA)靶向具有序 列同源性的基因组区。这些sRNA通过DNA甲基转移酶（DRM1/2、MET1、CMT3)的作用指导 DNA甲基化，并且推测这之后是涉及组蛋白甲基转移酶和脱乙酰酶的组蛋白修饰，以便建立 甲基化基因座处的抑制性染色质状态。
[0008] 利用转基因作为模式系统的早期研宄发现了与植物中TGS相关的一些基本特征。 (Mette et al.，2000 ;Jones et al.，2001 ;Sijen et al.，2001)这些研宄证实需要长发 夹结构产生靶向转基因启动子的sRNA。沉默的转基因的DNA分析显示对称和不对称的胞 嘧啶甲基化增加，并且MET1参与沉默基因座的维持。相似地，还显示长反向重复序列（IR) 介导水稻中35S启动子的高效TGS(0kano et al.，2008)。值得注意的是，正义（S)或反 义（AS)方向的单链沉默物在烟草和拟南芥中产生sRNA和产生TGS中是无效的（Mette et al. , 2000) 〇
[0009] 虽然围绕转基因的TGS的事件的顺序是相对明确的，但是不知道相似的步骤是否 也应用于内源基因座（此后为内源基因）的TGS。令人惊讶的是，到目前为止仅报道了几例 内源基因座的TGS，它们全部使用IR RNA。Cigan等人（2005)报道了两个玉米内源基因的 成功且强的沉默（Mark Cigan et al.，2005)。对于矮牵牛、马铃薯和水稻中的一些内源基 因，观察到中等沉默（Sijen et al.，2001;Heilersig et al.，2006;0kano et al.，2008)〇 在利用模式单子叶植物水稻的综合研宄中很好地说明了 IR RNA触发内源基因的TGS的无 效。有趣的是，水稻中检测的7个内源基因中的6个似乎抗拒通过产生自IR RNA结构的 sRNA沉默（Okano et al.，2008)。相比之下，在相同实验中显示35S启动子可以通过革巴向 该启动子的IR RNA有效沉默。在拟南芥中也报道了其他不成功的试验（八氢番茄红素不 饱和酶（H)S)和查耳酮合酶（CHS)) (Eamens et al.，2008)。合在一起，这些结果提示内源 基因座可能具有一些可以防止不期望的TGS的固有特性；或者，需要探索对内源基因座更 有效的沉默策略。除了观察到的在内源基因座处基因沉默的低成功率，内源基因的TGS和 DNA甲基化之间以及DNA甲基化和组蛋白修饰之间也有差异（Okano et al.，2008)。对于 水稻中的大多数情况，靶向启动子区的IR RNA可以触发同源序列的DNA甲基化，但是它们 不能诱导染色质修饰和TGS (Okano et al.，2008)。
[0010] 需要开发植物中转录基因沉默的核酸构建体和方法。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默（TGS)。更具体 地，本发明涉及能够进行植物、植物组织和植物细胞中内源基因的TGS的核酸构建体。本发 明进一步涉及利用本发明的核酸构建体通过TGS减少植物、植物组织或植物细胞中的内源 基因表达的方法。
[0012] 在第一方面，本发明提供包含如本文所述的植物可操作启动子的核酸构建体，所 述植物可操作启动子可操作地连接至本文所述的核酸沉默物分子。所述核酸构建体可以任 选地包括其他调节序列，例如3'调节序列，或者如本文所述的其他序列。本发明的核酸沉 默物分子包含植物内源基因靶标（即通过TGS下调的植物内源基因）的启动子区。所述核 酸沉默物分子编码单链沉默物，其为转录自核酸构建体的RNA分子，或者编码反向重复沉 默物，其转录自核酸构建体。所述单链沉默物或反向重复沉默物提供植物、植物组织和植物 细胞中内源基因的TGS。在一实施方案中，所述单链沉默物为产生自植物内源基因靶标的启 动子区的RNA分子（即，核酸沉默物分子），相对于核酸构建体中的植物可操作启动子，它是 反义方向的。在另一实施方案中，所述单链沉默物为产生自植物内源基因靶标的启动子区 的RNA分子（即，核酸沉默物分子），相对于核酸构建体中的植物可操作启动子，它是正义方 向的。在这些实施方案的每个中，所述构建体、核酸沉默物分子和单链沉默物中不存在反向 重复结构，即，核酸构建体和产生自它的产物中不存在反向重复结构或反向重复序列。在另 一实施方案中，所述核酸沉默物为产生自植物内源基因靶标的启动子区的RNA分子，其一 式两份提供，并且相对于核酸构建体中的植物可操作启动子，其以反向重复构型排列。核酸 沉默物分子的表达产生初始单链RNA。这种单链RNA可以通过细胞机制或由于反向重复结 构转化为双链RNA。
[0013] 在一实施方案中，所述核酸沉默物分子包含靶内源基因的转录起始位点上游的核 苷酸。在另一实施方案中，所述核酸沉默物分子包含靶内源基因的转录起始位点上游的核 苷酸和转录起始位点下游的核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸沉默物分子包含内源基 因的约300个连续核苷酸-约1500个连续核苷酸的启动子区。在其他实施方案中，所述核 酸沉默物分子包含内源基因的约400个连续核苷酸-约1200个连续核苷酸的启动子区。在 另外的实施方案中，所述核酸沉默物分子包含内源基因的约425个连续核苷酸-约1100个 连续核苷酸的启动子区。在进一步的实施方案中，所述核酸沉默物分子包含内源基因的约 425个连续核苷酸-约1075个连续核苷酸的启动子区。
[0014]在植物中可操作的任何启动子均可以用于所述核酸构建体以驱动所述核酸沉默 物分子的表达。在一些实施方案中，所述启动子为植物可操作启动子的单拷贝，包括本文所 述的那些启动子。在其他实施方案中，所述启动子为双拷贝的植物可操作启动子以产生同 源双启动子。在其他实施方案中，所述启动子为两个不同启动子的组合以产生异源双启动 子。
[0015]在第二方面，本发明提供包含所述核酸构建体的转基因植物细胞。在一实施方案 中，将所述核酸构建体稳定地整合入转基因植物细胞的基因组。在另一实施方案中，在转基 因植物细胞中表达所述核酸。
[0016]在第三方面，本发明提供包含所述核酸构建体的转基因植物。在一实施方案中，将 所述核酸构建体稳定地整合入转基因植物的基因组。在另一实施方案中，在转基因植物中 表达所述核酸。
[0017]在第四方面，本发明提供一种通过转录基因沉默减少植物、植物组织或植物细胞 中内源基因表达的方法。在一实施方案中，所述方法包括用所述核酸构建体转染植物细胞 以产生如本文所述的转基因植物细胞。所述方法进一步包括在如本文所述的转基因植物 细胞中表达所述核酸。在转基因植物细胞中切割表达的核酸，即本文所述的RNA单链正 义沉默物、RNA单链反义沉默物或IR沉默物，以便产生一个或多个诱导转录基因沉默的小 RNA (sRNA)，从而减少感兴趣的基因的表达。在一些实施方案中，所述核酸沉默物分子的表 达产生初始单链RNA。这种单链RNA可以在加工产生sRNA之前通过细胞机制或由于反向 重复结构转化为双链RNA。所述方法可以任选地包括制备编码如本文所述的单链沉默物或 IR沉默物的核酸构建体。在另一实施方案中，所述方法包括从转基因植物细胞再生转基因 植物。在这个实施方案中，在转基因植物中表达所述核酸。在转基因植物细胞中切割所表 达的核酸以产生一个或多个诱导转录基因沉默的sRNA，从而减少感兴趣的基因的表达。 [0018]在第五方面，本发明提供核酸构建体和方法以鉴定并获得来自内源基因的启动子 区的其他TGS沉默物。根据这个方面，所述核酸构建体是适合转化想要鉴定TGS沉默物的植 物物种的核酸构建体。在一实施方案中，所述核酸构建体可以包括在载体中。在一些实施 方案中，所述载体适合农杆菌（Agrobacterium)介导的转化。在其他实施方案中，所述载体 可以适合基因枪（biolistic)介导的转化。植物转化的其他合适载体是技术人员公知的。 在另一实施方案中，所述核酸构建体可以直接用于根据本领域技术人员公知的技术转化植 物。所述核酸构建体包含可操作地连接至推定的核酸沉默物分子的植物可操作启动子，所 述推定的核酸沉默物分子可操作地连接至植物可操作的3'调节区。在一实施方案中，所述 推定的核酸沉默物分子包含待测试的转录基因沉默的植物内源基因靶标的启动子区。在一 些实施方案中，所述推定的核酸沉默物分子相对于如本文所述的植物可操作启动子是正义 方向的。在其他实施方案中，所述推定的核酸沉默物分子相对于植物可操作启动子是反义 方向的。在其他实施方案中，所述推定的核酸沉默物分子包含如本文所述的反向重复序列 或反向重复结构。在一实施方案中，所述植物可操作启动子为双启动子，例如双35S CMV启 动子。在另外的实施方案中，所述植物可操作启动子为单启动子，例如单35S CMV启动子。 在一实施方案中，所述3'调节序列为TRV23'序列。在另一实施方案中，所述3'调节区为 polyA添加序列。在一实施方案中，所述polyA添加序列为NOS polyA。进一步根据这方面， 合适的TGS沉默物是通过这样的方法鉴定的，所述方法包括以下步骤：制备核酸构建体，其 包含如本文所述的感兴趣的内源基因的推定的核酸沉默物分子，用所述核酸构建体转化所 关注的植物物种的细胞或组织，并且确定转化的植物物种的细胞或组织是否加工所述推定 的核酸沉默物分子以产生所关注的内源基因的沉默。如果所述内源基因沉默，则感兴趣的 内源基因的推定的核酸沉默物分子鉴定为TGS沉默物。在一实施方案中，通过培养转化的 植物细胞用于表达推定的核酸沉默物分子并测试培养的转化植物细胞或组织中的转录基 因沉默来进行确定。在另一实施方案中，通过从转化的植物细胞或组织再生转化的植物并 测试转化的植物中的转录基因沉默来进行确定。根据本领域技术人员公知的技术进行转化 的植物的再生。
【附图