一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工 程领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是一种安全无毒以1，1_糖苷键构成的非还原性二糖，有三种异构体即 (a，a )、异海藻糖（0，0)、新海藻糖（a，0)，一般以二水化合物的形式存在。与蛋白质 或者氨基酸共同加热，不会产生美拉德反应，并且在酸性、碱性、高温、超低温环境都能保持 一定的稳定性。其独特的生物活性，使得海藻糖得到广泛的应用。大量的研宄表明，海藻 糖是单细胞生物、动物组织和器官、蛋白质、生物膜、医药制剂等的保护剂，能够抑制脂质酸 化、淀粉老化、蛋白质变性，具有矫味矫臭功能、搞玻璃转化温度、低吸湿性、低甜度等性质， 能够将其应用到医药业、农业、生化制品业、化妆品行业、食品加工业。
[0003] 早期商业化的海藻糖是从酵母中提取的。1990年价格约700美元/kg，提取率过 低，成本过高。1995年日本利用双酶法实现工业化生产，使得海藻糖价格由原来的2万日元 /kg大幅降到1997年的280日元/kg。中国2002年首次以双酶法实现海藻糖的产业化，价 格79元/kg。双酶法以淀粉为原料，在麦芽寡糖基海藻糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成 酶的作用下生成海藻糖，此法生产工艺复杂，难以推广，目前全世界只有几个公司能生产。 而海藻糖合酶以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，是相对经济的生产方法，但仍有很多 问题需要研宄解决，其中海藻糖合酶是关键。因此，挖掘适合生产海藻糖的海藻糖合酶对于 推动海藻糖的大规模工业化、降低产业成本具有重大的意义。
[0004] 麦芽糖可以通过水解淀粉得到，生产过程中会产生一定的葡萄糖，工业化生产海 藻糖使用纯的麦芽糖成本过高。海藻糖合酶除了转苷作用外还有微弱的水解反应，由此生 成副产物葡萄糖。本发明所使用的来源于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶若以工业级 的麦芽糖（含有1% -10%的葡萄糖）为底物，海藻糖合酶酶转化率会受到一定的影响。本 发明通过定点突变对海藻糖合酶进行改造，削弱葡萄糖对酶转化的抑制作用。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是提供一种海藻糖合酶的突变体，其活性中心位 点附近氨基酸发生突变，得到受葡萄糖抑制影响减弱的海藻糖合酶。所述突变体包括含有 一个、两个或三个相对于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶活性氨基酸残基的取代。
[0006] 所述海藻糖合酶的亲本的氨基酸序列与NCBI数据库中的Thermobifida fusca YX 海藻糖合酶一致（登录号WP_011291031. 1)。
[0007] 所述突变体是将亲本海藻糖合酶的第289位的谷氨酸（Glu)突变为甘氨酸（Gly)， 命名为E289G;或将第295位的组氨酸（His)突变成天冬酰胺（Asn)，所得突变体命名为 H295N ;或将第344位的甲硫氨酸（Met)突变成赖氨酸（Lys)，所得突变体命名为M344K ;或 将第367位的甲硫氨酸（Met)突变成亮氨酸（Leu)，所得突变体命名为M367L。
[0008] 所述突变体还可以是将单突变体酶H295N中第289位的谷氨酸（Glu)突变为甘氨 酸（Gly)，所得突变体命名为H295N/E289G ;或将单突变体酶H295N中第344位的甲硫氨酸 (Met)突变成赖氨酸（Lys)，所得突变体命名为H295N/M344K ;或将单突变体酶H295N基因 中第367位的甲硫氨酸（Met)突变成亮氨酸（Leu)，所得突变体命名为H295N/M367L。
[0009] 所述突变体还可以是将双突变体酶H295N/M344K基因中第367位的谷氨酸（Met) 突变成亮氨酸（Leu)，所得突变体命名为H295N/M344K/M367L。
[0010] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种受葡萄糖抑制影响减弱的海藻糖 合酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0011] (1)在ThermobifidafuscaYX海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定突变位点； 设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突 变体的质粒载体；
[0012] (2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
[0013] (3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化获得海藻糖合酶突变体。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任 意一种。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[0017] 本发明削弱了以工业级麦芽糖（含葡萄糖10% )为底物时葡萄糖对海藻糖合 酶生产海藻糖的抑制作用，以工业级麦芽糖（含葡萄糖10% )为底物，野生酶生产海藻 糖转化率为 62. 2%，而突变体 E289G、H295N、M344K、M367L、H295N/E289G、H295N/M344K、 H295N/M367L、H295N/M344K/M367L，生产海藻糖的转化率分别达到 69. 7%、70. 5%、70. 3%、 69. 6%、70. 4%、70. 9%、72. 3%、73. 7%，达到野生酶使用纯麦芽糖为底物时生产海藻糖的 转化率（70. 7% )。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 :重组菌构建
[0019] 实验室保藏有前期构建的含有编码海藻糖合酶的基因的质粒TreS/pMD18T。用于 构建大肠杆菌的质粒是pET24a(+)，带有17启动子。将pET24a(+)质粒和含有TreS基因的 质粒分别进行Nde I和Hind III双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产 物转化E. coli JM109感受态细胞，经37°C培养培养8h，挑转化子在含有30mg/L卡那霉素 液体的LB培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒TreS/pET24a(+)。
[0020] 将质粒TreS/pET24a(+)转化E. coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素（30mg/ L)的LB平板，37°C培养8h，命名为TreS/pET24a(+)/E. coli BL21(DE3)。挑单菌落到含有 30mg/L卡那霉素液体LB培养基中，37°C培养过夜，保存甘油管。
[0021] 实施例2:突变体的制备
[0022] (1)单突变
[0023] 来源于 Thermobifida fusca YX 的海藻糖合酶的突变体酶 E289G、H295N、M344K、 M367L。
[0024] 根据Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶的基因序列，分别设计并合成引入 E289G、H295N、M344K、M367L突变的引物，对海藻糖合酶基因进行定点突变，测定DNA编码序 列，分别鉴别出第289位的Glu密码子变成Gly密码子，第295位的His密码子变成Asn密 码子，第344位Met密码子变成Lys密码子，第367位Met密码子变成Leu密码子。将突变 体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变海藻糖合酶。单突变 E289G、H295N、M344K、M367L的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体TreS/pET24a(+) 为模板，
[0025] 引入E289G突变的定点突变引物为：
[0026] 正向引物：5 ' -GAATCCGGCGGCGAC迎TTGCCACATGAACT-3 '（下划线为突变碱基）反 向引物：5' -AGTTCATGTGGCAACCGTCGCCGCCGGATTCG-3' (下划线为突变碱基）引入 H295N 突 变的定点突变引物为：
[0027] 正向引物：5?-ATGCCACATGAACTTCAACTTCCCGCTGATGCC-3'(下划线为突变碱基）反 向引物：5' -GGCATCAGCGGGAAGTTGAAGTTCATGTGGCA-3,(下划线为突变碱基）引入 M344K 突 变的定点突变引物为：
[0028] 正向引物：5' -CGAGCTGACCTTGGAGAAAGTCAGCGATGAAG-3' (下划线为突变碱基）反 向引物:5'-TCTTCATCGCTGACTTTCTCCAAGGTCAGCTCG-3' (下划线为突变碱基）引入M367L 突 变的定点突变引物为：
[0029] 正向引物:5 ' -GCGGATGCGCGCCAACTTAGGGATCCGCCGCCGGC-3'(下划线为突变碱基）
[0030] 反向引物：5? -GCCG