一种在大肠杆菌中生产抗血管剂rt-x的方法及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及生物工程及医药技术领域，具体涉及在大肠杆菌中生产可溶性、有生 物活性的一种靶向性抗肿瘤血管抑制的融合蛋白RT-X的工艺和分离纯化方法。
【背景技术】：
[0002] 近年来随着肿瘤组织解剖学和分子生物学研宄的深入，人们逐渐意识到血管生成 对实体瘤生长和转移起到十分关键的作用。自1947年Algureza提出肿瘤诱导血管生成 的概念，直到1971年，folkman明确提出肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成的理论， 新生血管不仅为肿瘤生长提供所必须的营养和氧气，帮助排除代谢产物，还是其远处转移 的途径（Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent J. Natl. Cancer Inst. 1990:82:4-6)。由此，阻断肿瘤诱导的血管生成成为抑制肿瘤生长和 转移的潜在新策略。与传统的细胞毒性抗肿瘤疗法相比，血管生成抑制剂针对的是肿瘤血 管相关细胞，与肿瘤细胞遗传不稳定的性质不同，血管细胞主要是血管内皮细胞不易变异， 因此不容易产生耐药性。此外，由于在成人体内，除了少数生理病理过程如女性生理周期或 伤口愈合等，很少发生血管新生的过程，靶向血管的抑制剂导致的毒性也很低。更重要的 是，抑制血管生成能够阻断肿瘤转移的通道，而肿瘤的远处转移往往是其预后差的主要因 素。这些优势极大的激发了人们研宄靶向血管的抗肿瘤药物的热情，这方面的研宄已经取 得了一些进展，发现多种血管生成的抑制剂。这些抑制剂在临床上主要分为三大类：1、以替 尼类为主的小分子酪氨酸激酶受体抑制剂；2、针对血管生成相关因子的抗体；3、内源性的 血管生成抑制蛋白或者多肽。其中，小分子的抑制剂由于其特异性较低，容易引发较多的副 作用，而抗体类的药物虽然特异性高，但由于其通过哺乳动物细胞表达，制备工艺复杂，致 使价格昂贵。而内源性的血管抑制大分子不仅具有抗体药物特异性高的特点，并且可以通 过基因工程的方法进行原核细胞表达，实现大规模发酵，从而降低成本。此外，目前抗体类 药物集中以血管生成因子及其受体为靶点开发一系列药物，局限性较大，而内源性的血管 抑制剂的开发尚处于初步阶段，随着对血管调控机制研宄的深入，越来越多的调控大分子 被发现和开发为药物，如血管抑素（angiostatin)和内皮抑素（endostatin)等。因此，对 于内源性血管抑制剂的开发具有广大的空间和良好的应用前景。
[0003] Maspin蛋白为非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin)，在哺乳动物上皮细胞中表 达的二型月中瘤抑制蛋白（Zou et al.Maspin，a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells.Science 1994. 263,526-529 ;Berardi et al. Role of maspin in cancer. Clin Tran Med. 2013. 2(1)，8)。目前针对Maspin抗癌作用的报道已 有不少进展，数据显示maspin能够显著抑制肿瘤细胞的迀移和侵袭并且在小鼠模型中显 示抑制肿瘤转移的活性。新的研究发现maspin的具有血管生成调控功能，尤其是内皮细胞 对该蛋白异常敏感（Li et al. Targeted expression of maspin in tumor vasculatures induces endothelial cell apoptosis. Oncogene. 2005. 24 (12)，2008-2019)，因此， maspin有希望开发为新的内源性抗血管生成药物（Bodestine et al.Maspin:molecular mechanisms and therapeutic implications. Cancer Meta Rev. 2012. 31(3)，529-551) 〇但 有个问题不容忽视：目前对于maspin功能的研宄多基于细胞的maspin基因转染模型或制 备包含重组maspin蛋白的细胞栓模型进行体内外活性评价，这些模型的特点是能够使的 病灶处处于高浓度的maspin蛋白环境中，而由于maspin蛋白作用革巴点不明确，对血管的专 一性和选择性还不够好，因此系统给于重组maspin蛋白时，需要极大的提高剂量才能达到 理想的体内抗癌活性，势必增加该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制 难度加大、生产规模和生产成本增加、药物价格居高。
[0004] 因此，一个好的抗血管生产药物应该对新生血管的标记分子具有选择性，这样才 能在有新生血管的病灶处富集，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用，达到低剂量下 就能高效的抑制血管生成的效果。
[0005] 其中对肿瘤血管生成相关的重要肿瘤血管内皮标记之一是整合素家族的部分成 员。
[0006] 整合素是由a亚基和0亚基组成的跨膜蛋白异二聚体，研宄表明，肿瘤 细胞表明的整合素是肿瘤转移发生的关键所在，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白 和胞外基质分子的相互作用调控细胞的迀移、增殖和分化（Schoenwaelder SM.，et al.Bidirectional signalling between the cytoskeleton and integrins. Curr Opin Cell Biol. 1999. 11,274-286)。肿瘤细胞表面的整合素和正常细胞表达类型不同，尤其 是整合素ci5M、av05、CIV03等表达上调，且与血管新生及细胞迀移有关。目前正 在研究开发的a V0 3抗体有Vitaxin(LM609)，临床上用于抗血管生产治疗（Gutheil， JC. , et al. Targeted antiangiogenic therapy for cancer using Vitaxin:a humanized monoclonal antibody to the integrin alphavbeta3. Clin Cancer Res. 2000. 6,3056 -3061)，但是资料报道效果并不令人满意（Posey，JA.，et al. A pilot trial of vitaxin，a humanized anti-vitronectin receptor (anti alphavbeta3)antibody in patients with metastatic cancer. Cancer Biother Radiopharmac. 200L 16, 125 - 132)〇 20 多 种整合素中大多