人工生物粒子及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用了能够作为应用于药物释放系统（DDS)等的微囊而使用的穹窿 体（Vault)的新型的人工生物粒子及其制造方法。
【背景技术】
[0002] 穹窿体2是粒子尺寸为40nmX40nmX67nm的卵型的巨大的生物粒子，是在细胞内 具有最大的分子量的核酸-蛋白质复合体（参照图2)。存在于生物体内的穹窿体2是由 3 种蛋白质（MVP(MajorVaultProtein，穹窿体主蛋白）、VPARP(vaultpoly(ADP-ribose) polymerase，穹窿体多腺苷二磷酸核糖聚合酶）、TEP1 (telomerase-associated protein-1)，端粒酶相关蛋白质-1)和1种RNA构成的。对于穹窿体2,作为主要成分的分 子量约100kDa的MVP3聚集39个而形成碗型的一半穹窿体（各部位被称为帽5、肩部6、主 体7和腰部8)，以这2个碗的边缘与边缘吻合的方式在腰部8缔合而形成卵型粒子的外壳。 MVP以外的成分存在于由外壳形成的内部空间。
[0003] 构成穹窿体2的外壳的MVP3由以反向平行0片形成的9个重复结构（3a、3b、 3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i)、肩部6、帽螺旋9和帽环10共计12个结构域构成（图3)，帽螺 旋9的结构域间的分子间疏水键对于呈碗型的一半的穹窿体的形成是重要的。2个一半的 穹窿体通过使MVP3的N末端之间缔合而形成卵型的穹窿体粒子，该缔合仅由只有离子键 和短的分子间0片这样非常弱的相互作用而形成。这样的穹窿体的结构信息和粒子形成 的机理，由本发明人于2009年成功地阐明来源于大鼠肝脏的穹窿体的整体结构确定（例 如，参照HideakiTanakaetal.，''TheStructureofRatLiverVaultat3. 5Angstrom Resolution"、Science、Vol. 323、pp. 384-388 (2009)(非专利文献 1)。）。
[0004] 一直以来已知的是，穹窿体是在昆虫细胞中使作为其主要成分的MVP表达，从而 形成与生物体内相同的卵型的粒子（例如，参照AndrewG.Stephenetal./'Assemblyof Vault-likeParticlesinInsectCellsExpressingOnlytheMajorVaultProtein''、 TheJournalofBiologicalChemistry、Vol. 276、No. 26、pp. 23217-23220 (2001)(非专利 文献2)。）。穹窿体由于其特征的形态，用作微囊的药物释放系统（DDS)的开发推进（例 如，参照ValerieA.Kickhoeferetal.，"Engineeringofvaultnanocapsuleswith enzymaticandfluorescentproperties"、PNAS、Vol. 102，No. 12、pp. 4348-4352(2005) (非专利文献 3)、ValerieA.Kickhoeferetal.，"TargetingVaultNanoparticles toSpecificCellSurfaceReceptors'，、ACSnano、3(l) :27_36.doi:10. 1021/ nn800638x(2009)(非专利文献 4)。）。
[0005] 另外，例如，日本特表2013-509202号公报（专利文献1)中，公开了 ：具有MVP以 及融合蛋白质且mINT和重要对象的蛋白质（细胞因子）的重组粒子即穹窿体粒子，用于向 细胞或肿瘤或者对象输送作为重要对象的蛋白质。此外，例如，日本特表2007-508846号公 报（专利文献2)中，公开了如下技术：被多肽包裹的、用于输送多核苷酸的组合物，其具有 亮氨酸拉链作为多核苷酸结合区域。
[0006] 现有的方法中，为了将药剂吸收进粒子内部，作为穹窿体的构成成分且存在于粒 子内部的VPARP的C末端160个残基（INT结构域：与MVP结合）作为标记物而利用。这是 为了使粒子内部保持药剂。然而，该方法中，并没有充分地活用穹窿体的大的内部空间。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :日本特表2013-509202号公报
[0010] 专利文献2 :日本特表2007-508846号公报
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献 1:HideakiTanakaetal.，"TheStructureofRatLiverVault at3.5AngstromResolution"、Science、Vol. 323、pp.384-388(2009)
[0013] 非专利文献 2:AndrewG.Stephenetal./'AssemblyofVault-likeParticles inInsectCellsExpressingOnlytheMajorVaultProtein''、TheJournalof BiologicalChemistry、Vol. 276、No. 26、pp.23217-23220(2001)
[0014] 非专利文献 3:ValerieA.Kickhoeferetal.，"Engineeringofvault nanocapsuleswithenzymaticandfluorescentproperties''、PNAS、Vol. 102，No. 12、 pp.4348-4352(2005)
[0015] 非专利文献4:ValerieA.Kickhoeferetal./'TargetingVaultNanoparticles toSpecificCellSurfaceReceptors'，、ACSnano、3(l) :27_36.doi:10. 1021/ nn800638x(2009)
【发明内容】
[0016] 发明要解决的问题
[0017] 本发明是为了解决上述问题而做出的，其目的在于提供使用了能够作为可以应用 于药物释放系统（DDS)等的微囊而使用的、能够有效地利用其大的内部空间的穹窿体的新 型的人工生物粒子及其制造方法。
[0018] 用于解决问题的方案
[0019] 本发明的人工生物粒子的特征在于，在构成穹窿体的腰部的MVP的N末端分别整 合入亮氨酸拉链。
[0020] 本发明的人工生物粒子优选在MVP的N末端与亮氨酸拉链之间存在有连接子。该 情况下，连接子更优选为3~6个甘氨酸。
[0021] 本发明的人工生物粒子中，亮氨酸拉链优选来自酵母的转录活化因子GCN4。
[0022] 本发明还提供人工生物粒子的制造方法，其为制造上述的本发明的人工生物粒子 的方法，所述方法将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧，使其表达。
[0023] 本发明的人工生物粒子的制造方法中，将MVP基因与亮氨酸拉链基因不通过限制 性内切酶位点而用编码连接子的基因连接。
[0024]发明的效果
[0025] 通过本发明的人工生物粒子的制造方法，与现有技术相比较，能够格外地以高收 率得到人工生物粒子。本发明的人工生物粒子可以期待作为能够有效地利用其内部空间的 DDS等所能够应用的微囊，通过本发明收量提高了一个数量级，所以与大幅的降低成本相联 系。另外可以期待，将本发明的人工生物粒子作为基础，能够pH依赖地可逆地控制开闭的 粒子的开发推进。
【附图说明】
[0026] 图1为示意地表示本发明的人工生物粒子1中的、构成穹窿体2的MVP3的N末端 3a与亮氨酸拉链4的结合的示意图。
[0027] 图2为示意地表示本发明的人工生物粒子1所使用的穹窿体2的图。
[0028] 图3为示意地表示构成穹窿体2的MVP3的图。
[0029] 图4为示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊而应用的情况的图。
[0030] 图5为示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊而应用的药物释放系统的 一例的图。
[0031] 图6中，图6的左侧为示出破碎后的SDS-PAGE的结果的照片，分别地示出了对于 LZMVP_Gly3的上清（泳道A)、沉淀（泳道B)，对于LZMVP_Gly6的上清（泳道C)、沉淀（泳 道D)。另外，图6的右侧为表示蔗糖密度梯度离心分离后的SDS-PAGE的结果的照片，分别 地，左侧的组a表示对于LZMVP_Gly3的结果、右侧的组b表示对于LZMVP_Gly6的结果。
[0032] 图7是对于LZMVP_Gly3显示出最终纯化标准品的电子显微镜照片。
【具体实施方式】
[0033] 图1为示意地表示本发明的人工生物粒子1中的、构成穹窿体2的MVP3的N末端 3a与亮氨酸拉链4的结合的示意图。另外，图2为示意地表示本发明的人工生物粒子1所 使用的穹塵体2的图，图3为不意地表不构成穹塵体2的MVP3的图。如上所述，对于穹塵 体2,作为主要成分的MVP3聚集39个而形成碗型的一半穹窿体（各部位被称为帽5、肩部 6、主体7和腰部8)，以这2个碗的边缘与边缘吻合的方式在腰部8缔合而形成卵型粒子的 外壳（图2)。构成穹窿体2的外壳的MVP3是由以反向平行0片形成的9个重复结构（3a、 313、3(：、3(1、36、3厂3§、311、31)、肩部6、帽螺旋9以及帽环10共计12个结构域构成的（图3)。 本发明的人工生物粒子1的特征在于，在构成穹窿体2的腰部8的MVP3的N末端分别整合 入亮氨酸拉链4。
[0034] 本发明的人工生物粒子1优选在MVP3的N末端与亮氨酸拉链4之间存在有连接 子。通过存在有这样的连接子，可以确保在人工生物粒子1中的亮氨酸拉链4的运动的自 由度。