重组生促红素肝细胞受体a2拮抗剂及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种拮抗剂及其编码基因和应用，特别涉及一种重组生促红素肝细胞 受体A2 (EphA2)的拮抗剂及其编码基因和在拮抗EphA2受体、保护血脑屏障中的应用，本发 明属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 脑卒中是世界上导致人类死亡的主要疾病之一，是造成残疾的主要因素，其中 缺血性脑卒中约为 80 % (Moretti, A.，F. Ferrari and R. F. Villa, Neuroprotection for ischaemic stroke: current status and challenges. Pharmacol Ther，2015. 146:p. 23-34.)。目前缺血性脑卒中的主要治疗手段是通过溶栓药物使血 流恢复，从而阻止半暗带去极化。溶栓药物作为目前世界上主要的脑卒中治疗手段， 受到了很多因素的限制：如时间窗短，有较多出血发症，故只有少数病人能够得到治 疗(Appireddy, R. M. , et al., Endovascular therapy for ischemic stroke. J Clin Neurol，2015. 11(1) :p. 1-8.)。随着组织血流的恢复，组织得到能量供应，但同时会产生 大量氧自由基，对组织造成进一步损伤，也会有更大的出血风险，称之为"缺血再灌注损 伤"(Nour, M.，F. Scalzo and D. S. Liebeskind, Ischemia-reperfusion injury in stroke. Interv Neurol, 2013. I(3-4):p. 185-99.)〇
[0003] 神经保护剂作为溶栓的辅助用药，其目的是减轻再灌注损伤。然而在过去 的一段时间，虽然人们在动物实验中发现了很多具有良好效果的神经保护剂，但在 临床试验中的结果却不尽如人意，因此需要我们从更多的角度去解析脑缺血再灌 注损伤的机制并寻找潜在的有效治疗药物（Posada-Duque, R. A.，G. E. Barreto and G.P. Cardona-Gomez, Protection after stroke: cellular effectors of neurovascular unit integrity. Front Cell Neurosci, 2014. 8:p. 231.)〇
[0004] 近年来文献指出：血脑屏障（blood-brain barrier，BBB)的破坏与脑损伤 有紧密联系(Sandoval, K. E. and K. A. Witt, Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis, 2008. 32(2):p. 200-19.)〇 血脑 屏障是一种区分中枢神经系统和外围血液循环系统的多细胞血管性结构，其通过严格控 制分子和离子进出，及时供给神经元营养和氧气，同时保护大脑免受外来毒素和病原体 的入侵，维持神经元正常工作所需的内环境（〇bermeier，B.，R.Daneman and R.M.Ranso hoff, Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med，2013. 19(12) :p. 1584-96.)。BBB主要由内皮细胞，周细胞，胶质细胞及胞外基质组成。
[0005] 将神经元和其周围的细胞看成一个整体，称为神经血管单元（neurovascular unit，NVU)，之所以提出这样的概念是因为神经元周围的细胞组织通过供给神经元营养和 保护其免受外来刺激而发挥了无可替代的作用，缺血导致的神经元周围稳态的失衡和毒 素炎症因子的入侵与神经元的损伤有直接的关系（Posada-Duque, R. A.，G. E. Barreto and G.P. Cardona-Gomez, Protection after stroke: cellular effectors of neurovascular unit integrity. Front Cell Neurosci, 2014. 8:ρ· 231·)。因此脑卒中时保护血脑屏障的 完整性与保护神经元的作用同等重要。
[0006] 血脑屏障破坏造成脑损伤的过程如下：缺血或再灌注发生后，内皮细胞形态改 变、周细胞脱落、胶质细胞膨胀足突脱落、紧密连接降解、血脑屏障通透性改变，进而离子 失衡、毒性因子入侵、白细胞和血浆蛋白渗入、神经炎症反应激活，最终导致神经细胞坏 死和凋亡即脑损伤。同时溶栓使用的tPA作为MMPs的激活剂也可以直接导致紧密连接 的降解，从而破坏血脑屏障（Sandoval, K.E. and K.A. Witt, Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis,2008. 32(2):p. 200-19. Obermeier,B. ,R. Daneman and R. M. Ransohoff, Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med, 2013. 19(12):p. 1584-96.)〇
[0007] 因此我们希望寻找到一种可以保护血脑屏障的物质，在脑卒中发生时能够减轻脑 损伤。近来文献报道生促红素肝细胞受体（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor, Eph receptors)的激活会影响血管壁通透性，从而在脑损伤中发挥重要作用 (Coulthard, M. G. , et al. , Eph/Ephrin signaling in injury and inflammation. Am J Pathol, 2012. 181 (5) :p. 1493-503.)。Eph受体是酪氨酸激酶受体（RTKs)中最大的家族， 其配体为ephrins，Eph最初是作为与轴突导向相关的分子来研宄，随着研宄的进展Eph 的其他生物活性也逐渐被发现：作为轴突导向分子（最初），控制不同细胞间的相互作 用，骨盐代谢，突触的长时程增强和记忆，免疫系统，癌症（血管再生和生存信号），损伤和 炎症（Coulthard, M. G.，et al. , Eph/Ephrin signaling in injury and inflammation. Am J Pathol, 2012. 181(5):p. 1493-503. Himanen, J. P. , Ectodomain structures of Eph receptors. Semin Cell Dev Biol,2012. 23(I):p. 35-42.)〇
[0008] Eph受体和配体主要分为两类，A和B，其相互作用主要在同类间进行，但也有特 歹朱的情况（Himanen, J. P.，Ectodomain structures of Eph receptors. Semin Cell Dev Biol, 2012. 23 (I) :ρ· 35-42.)，其中的EphA2和印hrinAl对血脑屏障的通透性有重要的作 用。
[0009] 在体外实验中，通过添加EphA2的天然高亲和力配体--重组ephrinAl可 以降低紧密连接蛋白 Z0-1 和 occludin 的形成（Zhou, N.，et al.，Inactivation of EphA2 promotes tight junction formation and impairs angiogenesis in brain endothelial cells.Microvasc Res，2011.82(2):p. 113-21·)，ephrinAl 激活 EphA2 后，导致后者Tyr588和Tyr594位的氨基酸磷酸化并与Vav2和Vav3结合，进而导致内 皮细胞迁移的发生（Hunter, S.G.，et al·，Essential role of Vav family guanine nucleotide exchange factors in EphA receptor-mediated angiogenesis. Mol Cell Biol, 2006. 26(13) :p. 4830-42.)。同时在体外试验中，EphA2-/_的神经元细胞相比野生 型（WT)细胞对氧糖缺乏（OGD)有更强的耐受性；在小鼠的脑卒中模型中EphA2-/_的小鼠 对脑缺血再灌注有更好的耐受（Thundyil，J.，et al·，Evidence that the EphA2receptor exacerbates ischemic brain injury. PLoS One, 2013. 8(I):p. e53528.)〇
[0010] 综上所述，在缺血性卒中时，EphA2被ephrinAl激活产生下游信号，导致血管 内皮细胞形态改变，细胞间紧密连接蛋白水平下降，从而破坏BBB的完整性，加重脑损伤 (Coulthard, M. G. , et al. , Eph/Ephrin signaling in injury and inflammation. Am J Pathol, 2012. 181(5) :p. 1493-503.);将EphA2基因敲除后而BBB缺血性损伤显著降低。因 此，推测阻断受体EphA2的激活，也会产生和基因敲除相似的效果，即减轻血脑屏障损伤， 具有脑保护作用。
[0011] 鉴于eprhinAl为EphA2受体激动剂，而本发明的目的是寻找EphA2受体拮抗剂， 故本发明以其原始配体ephrinAl为骨架，选取其中一些与受体结合相关的序列，同时将与 激活相关的位点进行了的突变、替换，设计了四个新型的ephrinAl模拟肽（EM1、EM2、EM3 和EM4)，并对其进行了克隆、表达和纯化。然后，本发明利用小鼠中脑动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCA0)模型（Chiang, Τ·，R. 0· Messing and ff. H. Chou, Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp, 2011(48). Longa, E. Z. , et al. , Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989. 20(1) :p. 84-91.)和细胞模型对上述模拟肽的药理活性进行评价，通过实验 发现只有EM2能够拮抗EphA2受体，具有较好的减轻脑缺血损伤的作用，该作用是基于其对 血脑屏障的保护，本发明的提出为该多肽在脑卒中的应用奠定了基础。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题是提供一种生促红素肝细胞受体A2(EphA2)的拮抗 剂，该诘抗剂能够通过与EphA2原始配体ephrinAl的竞争性结合，达到抑制EphA2激活的 目的，从而达到保护血脑屏障，降低脑缺血再灌注损伤的目的。
[0013] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0014] 本发明以ephrinAl为骨架进行突变，保留用于结合的氨基酸序列或替换用于激 活的氨基酸序列，以发现可以和与EphA2配体结合位点发生作用的，但是本身又没有激活 作用的多肽。
[0015] 首先本发明发明人在NCBI蛋白质库网站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ protein/P20827.2)中获取了人源印hrinAl蛋白的目的基因（PDB ID:3HEI)，截取了与结 合相关的氨基酸，舍弃其他氨基酸，设计成为了 ephrinAl模拟肽-1(EM1，66-133位aa);然 后将ephrinAl模拟肽-1中的RFT替换为SWL，替换原有的活性序列，成为模拟肽-2 (EM2); 鉴于ephrinAl在与EphA2作用时G-H loop起主要作用，因此在ephrinAl模拟肽-1的