利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵领域，具体涉及利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方 法。
【背景技术】
[0002] 类胡萝卜素是一类脂溶性色素，大多难溶于水，可溶于有机溶剂，是全球生态系统 中的一大类色素，是自然界中分布非常广泛和十分重要的色素之一。类胡萝卜素能增加机 体免疫功能和细胞之间的缝间联接交流，具有抗氧化功能、抗癌功能、能量传递等重要功 能。因其抗氧化性，成为国际药物、膳食补充剂、功能食品等领域广泛关注的新型抗氧化活 性物质，被誉为二十一世纪抗氧化剂时代的"新贵"。
[0003] 化学合成的类胡萝卜素不易被人体吸收，并且有一定的毒副作用，没有被大规模 采用。相反，天然类胡萝卜素却受到越来越多的研宄与重视。目前，天然类胡萝卜素的来源 主要是从天然植物中提取和微生物发酵获取。从植物中提取类胡萝卜素的产量较低，提取 成本较高，浪费较大，并且受季节性影响较大。利用光合细菌发酵生产天然类胡萝卜素是目 前获取类胡萝卜素的重要来源之一。光合细菌广泛分布在江河、沼泽、海洋以及污泥等，生 命力非常强、容易培养、生长繁殖速度快、本身无毒，富含蛋白质、维他命，成为现代生物技 术研宄的热点。光合细菌富含天然类胡萝卜素，容易分离提取，色彩鲜艳。目前，光合细菌 色素广泛应用于油脂类、水果蔬菜类、豆制品和饮料等的着色。类胡萝卜素是光合细菌最 重要的光合色素之一，具有吸收光能的作用，其主要作用是抗光氧化破坏，驱散多余的辐射 能，保持捕光系统的结构和丰度。虽然光合细菌富含天然类胡萝卜素，但是目前光合细菌还 未真正用于工业化规模生产天然类胡萝卜素。其中一个重要原因在于目前采用的光合细菌 发酵生产天然类胡萝卜素方法是光照发酵法，该法非常耗时，发酵周期1-2周，甚至更长， 严重影响效率。因此，建立一种利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法是非常 必要的。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的 方法，方法简单，能够使光合细菌Rhodobacter sphaeroides类胡萝卜素合成途径结构基因 获得高效表达，菌体量大，类胡萝卜素产量高，具有良好的清除DPPH自由基的能力。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明的提供如下技术方案：
[0006] 利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：将活化的光 合细菌（Rhodobacter sphaeroides)单菌落接种到MMS培养基中，好氧过夜培养获得种子； 然后按接种量为8%将好氧过夜培养的种子分别接种到含有MMS培养基的培养瓶中，接种 后培养液体积相当于培养瓶体积的40%，然后在转速为200~250rpm、温度为30~32°C、 黑暗条件下好氧发酵至0D600为0. 6-0. 8 ;合并发酵液，使发酵液体积相当于培养瓶体积的 80%，再在转速为140~150rpm、温度为30-32°C、黑暗条件下微氧发酵36小时。
[0007] 优选的，所述好氧发酵的条件是在温度为30°C、转速为250rpm、黑暗条件下培养。
[0008] 优选的，所述微氧发酵的条件是在温度为30°C、转速为150rpm、黑暗条件下培养。
[0009] 优选的，所述活化的光合细菌由以下方法制得：先将光合细菌划线培养于MMS固 体培养基上至长出红色单菌落，然后挑取红色单菌落接种于MMS体培养基中至光合细菌长 至粉红色。
[0010] 优选的，所述MMS培养基的组分及浓度如下：DL-苹果酸3g/L ;MgS04X 7H20 0. 2g/ L ; (NH4)2SO4 I. 2g/L ;CaCl2X2H20 0· 07g/L ;微量元素溶液 I. 5ml/L，NaOH 调节 pH 至 6· 9,高 压蒸汽灭菌后按20ml/L和8ml/L分别加入50Χ磷酸溶液和维生素缓冲液；
[0011] 所述微量元素溶液各组分及浓度如下：Fe(III)-Citrat 500mg/L，MnCl2X4H20 20mg/L，ZnCl2 5mg/L，LiCl 5mg/L，KI 2. 5mg/L，KBr 2. 5mg/L，CuSO4 0·15mg/L ;
[0012] 所述50 X磷酸溶液各组分及浓度如下！K2HPO4 45g/L，KH2PO4 30g/L ;
[0013] 所述维生素缓冲液各组分及浓度如下：烟酸200mg/L，维生素 BI 400mg/L，烟酰胺 200mg/L，生物素 8mg/L。
[0014] 更优选的，诱导类胡萝卜素合成后还包括类胡萝卜素的提取步骤，具体为：收集发 酵液，离心收集菌体，然后向菌体中加入萃取剂重悬菌体，重悬后进行超声波破碎，再离心 收集上清，接着向上清液中按照料液比为1:40补足萃取剂浸提，离心收集上清，沉淀再按 料液比为1:40加入萃取剂浸提，再次离心收集上清液，合并上清液，减压蒸馏抽干，残余物 用乙醚溶解，然后加入等体积质量分数为10%的KOH甲醇液皂化，再用质量分数为5%的 NaCl溶液萃取，收集醚层并用质量分数为5%的NaCl溶液洗涤去除甲醇，最后抽干乙醚，得 类胡萝卜素；所述萃取剂为丙酮和甲醇体积比为7:2的溶液。
[0015] 本发明的有益效果在于：利用微氧发酵法，建立了一种利用光合细菌 Rb. sphaeroides快速发酵生产类胡萝卜素的方法，利用微氧黑暗条件快速发酵生产类胡萝 卜素，经发酵后离心收集菌体，用超声波破碎细胞，经丙酮甲醇（7:2)混合液分级浸提后减 压蒸馏抽干，用适量乙醚溶解后加入等体积的10%的KOH甲醇溶液皂化处理除去细菌叶绿 素，再用5 %的NaCl溶液分层处理分离甲醇和细菌叶绿素，最后减压蒸馏抽干得到类胡萝 卜素粉末，并进行清除DPPH自由基试验，该发明可用于利用微生物快速发酵生产类胡萝卜 素，且发酵时间短，仅用36h，较传统光照发酵法大大缩短了发酵周期，对促进光合细菌工业 化规模生产类胡萝卜素具有重要的意义。
【附图说明】
[0016] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0017] 图1为本发明的光合细菌微氧发酵大量合成类胡萝卜素后的颜色。
[0018] 图2为类胡萝卜素皂化前后的紫外可见扫描分析。
[0019] 图3为类胡萝卜素的TLC分析。
[0020] 图4为类胡萝卜素的稳定性分析。
[0021] 图5为类胡萝卜素清除DPPH自由基分析。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0023] 本发明所使用的实验材料如下：
[0024] (I)MMS 培养基（Malate Minimal Salt-Medium) :DL-Malic_Acid 3g/L ; MgSO4X 7H20 0· 2g/L ; (NH4)2SO4 I. 2g/L ;CaCl2X 2H20 0· 07g/L ;微量元素溶液（Trace Metal Solution) I. 5ml/L，NaOH调节pH至6. 9,高压蒸汽灭菌后分别按20ml/L和8ml/ L加入50X磷酸溶液和维生素缓冲液（参考文献见：Drew，G. (1983)Mikrobiologisches Praktikum. Heidelberg:Springge-Verlag)〇
[0025] (2)微量元素溶液：Fe (III)-Citrat 500mg/L，MnCl2 X 4H20 20mg/L，ZnCl2 5mg/L， LiC15mg/L，KI 2. 5mg/L，KBr 2. 5mg/L，CuSO4 0· 15mg/L，灭菌后 4°C保存。
[0026] (3)5〇 X 磷酸溶液！K2HPO4 45g/L，KH2PO43〇g/L。
[0027] (4)维生素缓冲液：烟酸200mg/L，维生素 BI 400mg/L，烟酰胺200mg/L，生物素 8mg，过滤灭菌，4°C放置。
[0028] (5)丙酮甲醇（7:2)混合液：准确量取丙酮350mL丙酮倒入500mL的棕色瓶中，然 后加入IOOmL的甲醇，混匀。
[0029] (6) 10% KOH甲醇溶液：准确称取100g Κ0Η，溶于适量的甲醇中，搅拌溶解，补充甲 醇至 10OOmT,η
[0030] (7) TLC展开剂：正己烷：甲醇：丙酮按体积比为70:29:1混合。
[0031] (8)0.1 mM DPPH :精密称取3. 9mg DPPH，用移液管量取IOmL甲醇溶解到比色管，再 用移液管转移到IOOmL容量瓶中，甲醇定容至100mL，即配成0.1 mM的DPPH。
[0032] (9)5% NaCl :准确称取50g NaCl，溶于适量的水中，充分溶解，补充水至1000mL。
[0033] 实施例1、光合细菌的活化
[0034] 将_80°C保存的光合细菌（Rb. sphaeroides)划线培养于MMS固体培养基上，在 30°C培养大约4d长出红色单菌落；然后，挑取红色单菌落接种于装有10~20mL MMS液体 培养基的50mL锥形瓶中，再在30°C、200rpm条件下培养18h，至