拟态弧菌ta系统毒素蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种拟态弧菌（Vibriomimicus)TA系 统毒素蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】：
[0002] 毒素-抗毒素（toxin-antitoxin,TA)系统最初发现于一些低拷贝质粒中，它们是 一对密切相关的基因组合，其中一个编码稳定的毒素，另一个编码不太稳定的抗毒素（王 晓蕾等，2008)。当细菌细胞分裂时，如果子代细胞丢失此质粒，不太稳定的抗毒素很快降 解，而稳定的毒素则发挥毒性杀死细胞，这种效应被称作分裂后致死效应，质粒借此得以在 宿主中稳定存在（Jump等，2001)。随着生物测序技术及生物信息学分析技术的发展，至 2008年已经在测序的原核生物中发现671个TA系统位点，分布于126个物种中，它们隶属 于7个经典的TA基因家族。（王晓蕾等，2008)。TA系统并不局限于细菌质粒中，也存在于 细菌染色体的一些潜在的移动遗传元件上（Ghafourian等，2013)。
[0003] 近年来，微生物学家开始在生物研宄中应用细菌的TA系统作为工具，来自于TA系 统的致死基因常用作载体的选择标记（Ghafourian等，2013)。其中以致死基因ccdB、sacB 应用最为广泛。克隆基因片段是分子生物学最常规的操作，进行微生物的基因缺失突变是 微生物分子生物学最常见的研宄基因功能的手段。ccdB常用于制作克隆载体或基于基因 缺失目的用于反向选择的标记（如：Bernard等，1996 ;Mondon等2000 ;Traore等，2011); sacB则常用于构建自杀载体，便于同源重组子的反向筛选（Kaniga等，1991 ;Philippe等， 2004 ;Qu6n6e等，2005)。Invitrogen公司基于ccdB基因构建了一系列用于克隆的商业化 载体，用于提高阳性克隆筛选的效率等目的（贾丼等，2009)。然而在实际应用中，我们发 现含有ccdB源质粒的大肠杆菌在IPTG诱导的情况下，平板上仍然会有一些克隆长出，表 明ccdB的毒性并非足够强烈到杀死所有的大肠杆菌细胞或者细菌细胞容易针对ccdB的 靶位点进行自我修饰；此外还发现：当ccdB源的自杀载体发生第一次同源重组整合至弧菌 基因组时，在IPTG诱导的情况下则完全不能发挥杀死弧菌细胞的作用，这表明ccdB表达 产物的毒性具有宿主特异性。来源于芽孢杆菌的sacB致死基因表达后会代谢蔗糖并产生 对多数革兰氏阴性菌致死的代谢产物（Gay等，1985)，然而后来发现在基于sacB自杀质粒 的同源重组中，一些细菌对于蔗糖代谢产物并不敏感，导致缺失突变株的筛选并不容易成 功（Milton等，1996);此外，sacB容易发生自发点突变，造成筛选时大量假阳性克隆的出现 (Blomfield等，2006)。
[0004] 综合上述，迫切需要发掘微生物遗传资源，筛选出新的具有广泛适用性和足够强 烈毒性的致死基因，并应用于克隆载体或自杀载体，新的微生物致死基因的应用将大大提 高目的片段阳性克隆的效率或筛选缺失突变体的效率。
【发明内容】
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[0005] 本发明的第一个目的是提供一种拟态弧菌TA系统毒素蛋白及其编码基因。
[0006] 本发明的拟态弧菌TA系统毒素蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo. 2 所示。
[0007] 本发明的编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如 SEQIDNo. 2所示的拟态弧菌TA系统毒素蛋白。
[0008] 编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因，优选，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。 [0009] 本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述编码拟态弧菌 TA系统毒素蛋白的基因。
[0010] 所述的表达载体，优选为严谨控制型表达载体PBAD30。长期以来缺乏既能在大肠 杆菌内进行遗传操作并复制，又能在弧菌等海洋细菌中稳定保存的穿梭表达载体。本发明 通过实验手段证实了PBAD30是一种穿梭能力强的表达载体，且能方便地对插入基因进行 开启和关闭。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。
[0012] 本发明的第四个目的是提供编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因在构建克隆载 体和自杀载体中的应用。
[0013] 本发明首先在拟态弧菌LP177的基因组survey中发现了一个具有潜在移动能力 的基因岛GIVmi573,在进一步对GIVmi573进行生物信息学解析时发现一对基因vmi480/ Vmi470,其疑似TA系统。为了验证其功能，本发明通过基因缺失方法验证vmi480功能，该 方法主要采用A同源重组的方式对vmi480及功能相关基因vmi470进行敲除，首先分别构 建Avmi48〇-470、Avmi480、Avmi470缺失突变株，再构建pBAD3〇-vmi480表达载体，将此 表达载体成功电转入大肠杆菌、野生海洋细菌溶藻弧菌E001和海藻施万氏菌E114，并在其 中操控表达，以此确定其对于弧菌、海藻施万氏菌以及大肠杆菌等具有强烈的致死作用。
[0014] 本发明首次在拟态弧菌中发现了TA系统的存在，并通过实验手段证实了TA系统 中关键毒素基因vmi480的功能，实验结果表明vmi480是一种新型的毒素基因，该基因的产 物对细菌细胞具有强烈的致死作用，且毒性作用范围广泛，因此可以替代目前应用广泛但 假阳性较严重的致死基因ccdB、sacB等。在实际应用中只需要将vmi480替换以往克隆载 体中使用的ccdB基因（如：Invitrogen公司的系列Gateway?'载体）等毒素基因即可，或 用于替代自杀载体中用于反向选择的毒素基因，如：sacB(如：Qu6n6e等，2005)。将vmi480 应用于克隆载体和自杀载体的构建将大大提高阳性重组子的筛选效率，减少实验室的工作 量。鉴于基因克隆以及基因功能研宄的广泛性，vmi480将有广阔的应用前景并产生可观的 经济价值。
[0015] 本发明的拟态弧菌（Vibriomimicus)LP177为发明人所在实验室保藏，本申请人 保证自申请日起20年内向公众提供该拟态弧菌（Vibriomimicus)LP177。
【附图说明】：
[0016] 图1是毒素基因vmi480所在操纵子结构示意图，其中P代表启动子区；
[0017] 图2是与毒素基因vmi480相关的基因vmi470编码蛋白保守结构域，其中黑色三 角形代表Vmi470与抗毒素蛋白HipB在保守结构域基序中共有的氨基酸残基位点；
[0018] 图3是毒素基因vmi480编码蛋白的Blastx比对结果图；
[0019] 图4是毒素基因vmi480在不同细菌中的严谨控制表达，其中1A，1B，1C分别代表 大肠杆菌NEB5a(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生长情况；2A，2B，2C分别代表溶藻弧 菌E0601 (pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生长情况；3A，3B，3C分别代表海藻施万氏菌 E114(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生长情况。
【具体实施方式】：
[0020] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未 注明具体实验条件和方法的均为采用本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0021] 以下实施例中所涉及的材料及来源如下：
[0022] 拟态弧菌LP177为本实验室保存菌株，pBAD30、pKD46、pKD4、pCP20、pVCR94质粒 及其宿主大肠杆菌NEB5a、大肠杆菌MG1655由加拿大舍布鲁克大学馈赠。EcoRI、XbaI、 T4DNA连接、ThempolTaq聚合酶、pfu高保真酶、Q5高保真酶、PCR产物纯化试剂盒、质粒提 取试剂盒购自NEB公司。LB培养基购自Amersco公司。脑心浸液培养基购自BD公司。
[0023] 实施例1 :
[0024] 1、拟态弧菌LP177基因组测序、注释及vmi480基因发现
[0025] 传统酚/氯仿法提取拟态弧菌LP177基因组DNA，DNA送交华大基因（深圳）进行 Illumina平台测序，测序共获得127个scaffold序列。序列递交在线RAST微生物基因组注 释工具（ http://rast.nmpdr.org/)进行注释。在对注释结果进行分析时，发现scaffold7 序列存在一个完整的疑似可移动的小型基因岛，命名MGIVmi-1。
[0026] 对MGIVmi-1详细分析发现，该小型基因岛具备左右二端相同的att位点、整合酶 基因int，剪切酶基因xis，参与识别转移起始位点（oriT)的基因mobl以及在整合性结合 元件（ICE)中常见的限制性修饰系统（RM)。其它多数基因功能未知，基因vmi480与vmi470 紧密相邻，位于同一操纵子上（如图1所示）。
[0027] Blastx(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi?CMD=ffeb&PAGE_TYPE= BlastHome)搜索发现Vmi470属于可以与DNA结合的XRE蛋白家族成员，大肠杆菌TA系统 的hipB抗毒素蛋白与Vmi470相似性非常低（小于30%)，但是二者同属XRE家族，具有相 同的关键基序的残基（如图2所示），因此推测二者具有类似的功能。Blastx搜索未得到 vmi480潜在功能的任何预测结果，提示这是一个功能未知的新基因（如图3所示）。
[0028]vmi480基因DNA序列如SEQIDNO. 1所示，vmi480编码氨基酸序列如SEQIDN0. 2 所示。
[0029] 2、拟态弧菌LP177基因vmi48