一种来源于葡萄的抗逆基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于葡萄的抗逆相关的基因。
【背景技术】
[0002] 自然界中，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各 种逆境，植物常在不利的环境条件下生长，如干旱、水涝、盐害、低温、高温、病虫害等。对农 业生产来说，各种逆境是影响作物产量和品质最直接、最重要的因素。因此，加强植物抗性 生理的研宄，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，培育具有抵抗不良环境 性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。
[0003]谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferase，简称GST，EC2. 5. 1. 18)是广 泛分布于植物、动物、鸟类、昆虫及微生物体内的一组多功能同工酶，其主要功能是催化各 种亲电子化合物与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性而易于穿越细胞膜，分解后 排出体外，从而达到解毒的作用。植物GST分为8类，分别为phi(F)，tau(U)，theta(T)， zata(Z),lambda(L),DHAR,TCH0D和MAPEG。其中，最大的两类phi(F)和tau(U)为植 物所特有，在植物修复有机化合物，尤其是对除草剂的分解过程中起着至关重要的作用。此 外，在提高植物抗逆性方面也具有重要的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种来源于葡萄的抗逆相关的GST基因。
[0005] 所说的葡萄抗逆相关基因，是VvGSTl，它具有SEQIDNol的序列。
[0006] 上述基因编码的蛋白质，它具有SEQIDN〇2的氨基酸序列。
[0007] 上述基因VvGSTl能用于植物遗传转化，在制备抗逆的转基因植物中的应用。
[0008] 上述所说的葡萄抗逆相关基因VvGSTl，是通过以下方法得到： 1.葡萄cDNA文库的构建 本发明将葡萄幼苗种植在黑土：蛭石：珍珠岩（1:1:1)混合基质中，22 °C，16h光照 培养生长一个月。选生长健壮的幼苗提取总RNA。以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物， 参照全式金生物科技有限公司cDNA合成试剂盒说明（http://www.transgen.com.cn)，在 AMV反转录酶的作用下合成cDNA。
[0009] 2?引物的设计与合成 本发明设计一对引物，引物两端分别引入和feci的酶切位点。
[0010]VvGST1-F：5r -AAGGATCCATGGCGCTCAAGCTCCATGGAATTC-3r VvGST1-R： 5r -AAGAGCTCTCACTTCTCACCAAAAGTCATGCCTTC-3r 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成（http://www.sangon.com)。
[0011] 3.PCR方法获得葡萄抗逆相关基因VvGSTl片段 本发明的PCR扩增采用大连宝生物工程有限公司（http://takara.com.cn)的PCR试 剂，在50y1的体系中进行PCR反应，反应参数为：94 °G预变性1min，94 °G变性30s;55 °G退火30s;72 〇G延伸lmin;共扩增30个循环，在72 °G延伸10min。经过1. 0%的琼脂糖 凝胶电泳检测扩增产物为一条约600bp的片段。
[0012] 4.克隆鉴定与序列测定 扩增片段采用爱思进生物技术(杭州)有限公司（http://axygenbio.com)DNA琼脂糖 凝胶回收试剂盒回收后，克隆到大连宝生物有限公司的pMD-18-SimpleT载体上进行克隆 鉴定和序列测定。
[0013] 5?序列分析 本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得葡萄抗逆相关基因VvGSTl，其核苷酸序列 信息如SEQIDNol所示，其氨基酸序列如SEQIDNo2所示。
[0014] 本发明所述的抗逆基因VvGSTl能用于植物遗传转化，在培育提高抗逆性(抗盐、 抗干旱）植物中的应用。
[0015] 本发明实现的有益效果： 本发明克隆了葡萄VvGSTl基因，为了进一步分析该基因在盐、干旱逆境中的作用与 功能，我们比较了转VvGSTl基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对盐、干旱胁迫的耐受 性。结果表明，野生型拟南芥和转VvGSTl基因的拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转 基因植株比野生型植株有明显的抗盐、抗干旱能力，这也表明VvGSTl基因的转入提高了拟 南芥植株的抗盐、抗干旱能力。
【附图说明】
[0016] 图1 :琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物。
[0017] 图2 :琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0019] 下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括： 葡萄（Kirifli/era)的幼苗种植在黑土：輕石：珍珠岩（1:1:1)的混合基质中， 22 °C，16h光照培养（16h光照，8h黑暗，冷光源）生长一个月。
[0020] 大肠杆菌coJ7)DH5a由上海市农业科学院生物技术研宄所植物 基因工程研宄室保存。克隆载体PMD-18-SimpleT、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接 酶、dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试 剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
[0021] 下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【SambookJ，FretsEF， MannsdesTetal.In:MolecularCloning. 2nded.ColdSpringHarborLaboratory Press? 1989]〇
[0022] 实施例1 葡萄幼苗RNA的抽提和cDNA合成 (一）试验方法： 1.RNA抽提 加入100ml提取缓冲液(葡萄RNA提取缓冲液配方：CTAB 3% (w/v);PVP3% (w/v);EDTA 25mM;NaCl2.OM;Tris-HCl100mM，pH8. 0;DEPC0? 1% (v/v);0. 1%DEPC处理的SDS0? 5% (w/v) ;0? 1%DEPC处理的LiCl10M)到 50ml聚丙烯管，65°C预热； 称取5g植物材料，倒入液氮使材料保持冻结和易碎的状态，研磨； 研磨后的细粉转移至65°C预热的提取缓冲液中，65°C水浴45min，并偶尔摇动以混合各 成分； 加入等体积氯仿一异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合各成分； 在 4 °C，于 12000g离心 10min; 吸取上清液，加入1/4体积的10MLiCl溶液，彻底混匀，4°C放置12h; 在 4 °C，于 12000g离心 30min; RNA沉淀用0.5mlDEPC处理的去离子水轻柔溶解，用氯仿一异戊醇混合液抽提，4 °C， 12000g离心 30min; 上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积-20 °C预冷的无水乙醇，充分混匀，放置在 -20 °C条件下2h，沉淀总RNA; 4 °C，12000g离心30min，用75%乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干； 用0.2mlDEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余储 存于-70 〇C，备用。
[0023] 2.cDNA合成 加入Oligo(dT) 18 (10pmol/yl) 1yl;总RNA: 10-100ng;补足RNaseFreeH20 到 7y1 〇
[0024] 65 °C，5 min后，立即置于冰上。
[0025]再加入 2XTSReactionMixBuffer