与肺腺癌转移相关的微小rna的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及miR-660和/或miR-302a在诊断肺腺癌转移、制 备抑制肺腺癌转移、侵袭药物组合物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的首位死因。每年确诊的肺 癌病例约161万例，占恶性肿瘤的12. 7%，肺癌相关死亡约138万例，占癌症相关死亡的 18. 2%。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在中国大多数地区占第 一位，在大城市及工业污染重的地区尤为显著。随着中国人口的持续增长和人口老龄化的 加剧，加之生活方式、社会、经济和环境等因素的改变，肺癌的发病率和死亡率呈明显上升 趋势。
[0003] 微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小 核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、 组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧 密的联系。最近的研宄发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖 核酸的表达水平均有不同程度的下调（LawrieCH，GalS，DunlopHMetal.Detectionof elevatedlevelsoftumor-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuse largeB-celllymphoma.BrJHaematol2008 ;141 :672_675);分析比较人肺癌、乳腺癌组 织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常 组织发生了变化（GarofaloM，QuintavalleC，DiLevaGetal.MicroRNAsignaturesof TRAILresistanceinhumannon-smallcelllungcancer.Oncogene2008)。也有石开宄 证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展，并且 与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联（TryndyakVP，RossSA，Beland
[0004] FA,PogribnyIP.Down-regulationofthemicroRNAsmiR-34a,miR-127,and miR-200binratliverduringhepatocarcinogenesisinducedbyamethyl-deficient diet.MolCarcinog. 20080ct21)。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾 病发生和发展之间存在着必然联系。
[0005] 由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它 与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制 因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表 达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通 路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是 因为当疾病（如癌症）发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧 烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。
[0006] 因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性 变化必然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通 过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸或过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓 解疾病的发生和发展。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种可用于判断肺腺癌转移、用于制备抑制肺腺癌转 移、侵袭药物的微小RNA标记物。
[0008] 本发明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种用于预判肺腺癌转移风险、诊断肺腺癌是否发生转移、判断 肺腺癌转移是否复发的微小RNA标记物，所述微小RNA选自以下组中的至少一种：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA; 前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-660和/或 miR_302a〇
[0011] 应当知道，本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突 变。
[0012] 本领域人员应该了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两 端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的 功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-660和miR-302a功能的条件下，对miR-660 和miR-302a进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围 之内。
[0013] 在本发明的一些具体的实施方式中，所述miR-660和所述miR-302a是成熟 miR-660和成熟miR-302a。所述成熟miR-660包括miR-660-5p、miR660-3p，它们共同享有 共同的种子序列；所述成熟miR-302a包括miR-302a-5p、miR-302a-3p，它们共同享有共同 的种子序列。
[0014] 虽然在某些【具体实施方式】中所使用的是成熟miRNA，但是本领域技术人员可以预 期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一 步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
[0015] 本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单 链形式，而前体miRNA是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、 DNA、PNA、LNA的形式。
[0016] 本发明提供了所述miR-660和/或miR-302a在制备预判肺腺癌转移风险的工具 中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述miR-660和/或miR-302a在制备诊断肺腺癌是否发生转移 的工具中的应用。
[0018] 本发明的实验证明已发生转移的肺腺癌组织中miR-660和miR-302a的水平显著 低于为发生转移的肺腺癌组织中miR-660和miR-302a的水平。因此，与不发生转移的肺腺 癌组织中的miR-660和miR-302a的水平相比，如果受试者肺腺癌组织中miR-660和/或 miR-302a的水平显著降低，那么则可以判断该受试者肺腺癌细胞转移的风险高或者已经 发生了转移，从而采取预防肺腺癌细胞转移的方案或者为临床治疗方案的制定提供诊断基 础。
[0019] 本发明还提供了所述miR-660和/或miR-302a在判断肺腺癌转移复发的工具中 的应用。与不发生转移的肺腺癌组织中的miR-660和miR-302a的水平相比，如果已经接受 了手术治疗的受试者肺腺癌组织中miR-660和/或miR-302a的水平显著降低，则表明受试 者肺腺癌细胞再次发生了转移。
[0020] 进一步，上述预判肺腺癌转移风险、判断肺腺癌是否发生转移、判断肺腺癌转移 复发的工具包括但不限于，芯片、试剂盒。所述工具包括用于待测样本中miR-660和/或 miR-302a表达水平的试剂。所述试剂可以是针对miR-660和/或miR-302a的引物或探针。
[0021] 本发明还提供了上述miR-660和/或miR-302a在高通量测序平台中的应用。通 过高通量测序能获知待检测样本肺腺癌组织中miR-660和miR-302a的表达水平，将待测样 本的结果同未发生转移的肺腺癌组织相比，容易判断待测样本是否存在转移的风险或者容 易判断待测样本是否已经发生了转移、或者判断肺腺癌转移是否复发。因此，经过高通量测 序获得miR-660和miR-302a与肺腺癌转移相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之 内。