M971嵌合抗原受体的制作方法
【专利说明】M971嵌合抗原受体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年10月24日提交的美国临时申请第61/717, 960号的权益， 其全部内容通过引用并入本文。
[0003] 以电子方式提交的材料通过引用并入
[0004] 通过引用整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核 苷酸/氨基酸序列表：名称为"714144_ST25. txt"，日期为2013年8月30日的一份31，786 字节ASCII (文本）文件。
[0005] 发明背景
[0006] 癌症为公共健康问题。虽然在治疗诸如化疗中有所进展，但对于许多癌症，包括血 液恶性肿瘤的预后可能很差。例如，据估计，2000年在美国预期超过45, 000例死亡是由于 非霍奇金氏淋巴瘤和白血病（Greenlee等，CA Cancer J. Clin. ,50:7-33 (2000))。因此，存 在对癌症，特别是血液恶性肿瘤的其他治疗的未得到满足的需求。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明的实施方案提供包含含有SEQ ID NO: 1-6的抗原结合结构域、跨膜结构域 和细胞内T细胞信号传导结构域的嵌合抗原受体（CAR)。
[0009] 本发明的其它实施方案提供涉及本发明的CAR的相关的核酸、重组表达载体、宿 主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分以及药物组合物。
[0010] 本发明的另外的实施方案提供检测哺乳动物中存在癌症的方法以及治疗或预防 哺乳动物中癌症的方法。
[0011] 附图中几个视图的简要说明
[0012] 图IA至图IG为示出在不同的效应物与靶标（E:T)比率下，靶标51Cr标记的白血 病细胞系 REH(A)、SEM(B)、NALM6-GL (C)、K0PN8 (D)、Daudi (E)、Raji (F)和 K562 (G)被未转 导的（模拟，鲁；圆形）或用以下CAR(HA22-SH-第二代第1版（▼ )，m971-第二代第1版 (▲;空心三角形）或CD19-特异性CAR(_ ;正方形））转导的人T细胞效应物裂解％的图。
[0013] 图2A至图2C为示出在不同的E:T比率下，靶标白血病细胞系Raji (A)、 NALM6-GL(B)或K562(C)被未转导的T细胞（模拟，鲁；圆形），m971-第二代第1版CAR(A) 或m971-第三代CAR( ▼)效应物裂解百分比的图。
[0014] 图3A至图3C为示出在与白血病细胞系NALM6-GL(CD22? ) (A)、Raji (CD22高）（B) 或K562(CD22-阴性）（C)共培养后，由未转导的（模拟）或用以下CAR中的一种（抗-CD19， m971-第二代第 1 版（SEQ ID N0:23)，m971-第三代（SEQ ID N0:24)，HASH22-第二代第 1 版，HASH22-第二代第2版或HASH22-第三代）转导qA分泌的干扰素（IFN)-Y (pg/ml)的 量的图。 ^
[0015] 图3D至图3F为示出在与白血病细胞系NALM6-GL(CD22? ) (A)、Raji (CD22高）（B) 或K562(CD22-阴性）（C)共培养后，由未转导的（模拟）或用以下CAR中的一种（抗-CD19， m971-第二代第 1 版（SEQ ID N0:23)，m971-第三代（SEQ ID N0:24)，HASH22-第二代第 1 版，HASH22-第二代第2版或HASH22-第三代）转导的T细胞分泌的白细胞介素（IL)-2(pg/ ml)的量的图。
[0016] 图3G至图31为示出在与白血病细胞系NALM6-GL(CD22is) (A)、Raji(CD22hi)⑶或 K562(CD22-阴性）（C)共培养后，由未转导的（模拟）或用以下CAR中的一种（抗-CD19， m971-第二代第 1 版（SEQ ID N0:23)，m971-第三代（SEQ ID N0:24)，HASH22-第二代 第1版，HASH22-第二代第2版或HASH22-第三代）转导的T细胞分泌的肿瘤坏死因子 (TNF)-a (pg/ml)的量的图。
[0017] 图4A为示出在30天的时段内测量由荧光素酶（转染到白血病细胞内，所述白血 病细胞被注射到小鼠）与注射至小鼠的焚光素反应生成的生物发光信号（光子/s/cm 2/sr) 的图。用对照T细胞（"模拟"，未转导的，鲁；圆形）或用HASH22CAR-第二代第1版（; 正方形）或m971-第二代第1版（三角形，SEQ ID NO: 23)转导的T细胞处理小鼠。光子/ s/cm2/sr值越高指示肿瘤负荷越大。
[0018] 图4B为示出用对照T细胞（"模拟"，未转导的，正方形）或用HASH22CAR-第二 代第1版（圆形）或97ICAR-第二代第1版（三角形，SEQ ID NO: 23)转导的T细胞处理 的小鼠在30天的存活百分比的图。（模拟V. HA22，p = 0. 0019 ;模拟V. m971，p = 0. 0019 ; m971v. HA22, p = 0·003)。
[0019] 图5为示出在用未转导的T细胞（模拟）或用编码m971-第二代第2版CAR (SEQ 10勵:22)的核苷酸序列转导的151106、51106、11106或1110 51'细胞治疗患有白血病的 小鼠之后三天、五天和八天的生物发光图像的表。从灰至白的阴影变化指示肿瘤负荷增加。
[0020] 图6为示出在44天的时段内，图5中显示的小鼠的生物发光发射的光子总数目的 图。对光子总数目进行定量并且作图，并示出每个时间点的平均值和标准差。用未转导的T 细胞（模拟）（加号符号）或用编码m971-第二代第2版CAR (SEQ ID NO: 22)的核苷酸序 列转导的15x 106(菱形）、5x 106(花）、lx 106(十字）或Ix 105(星号）T细胞治疗小鼠。
[0021] 发明详述
[0022] 本发明的实施方案提供包含含有SEQ ID NO: 1-6的抗原结合结构域、跨膜结构域 和细胞内T细胞信号传导结构域的嵌合抗原受体（CAR)。
[0023] CAR为人工构建的杂合蛋白质或多肽，所述杂合蛋白质或多肽含有连接至T细胞 信号传导结构域的抗体的抗原结合结构域（如，单链可变片段（scFv) )。CAR的特性包括它 们能够以非-MHC-限制的方式重定向T细胞对选定的靶标的特异性和反应性，从而利用单 克隆抗体的抗原结合性质。非-MHC限制的抗原识别使表达CAR的T细胞能够识别不依赖抗 原加工的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，有利的是，CAR 不会与内源性T细胞受体（TCR) α链和β链二聚化。
[0024] 本文使用的短语"具有抗原特异性"和"引发抗原特异性应答"意指CAR可特异性 结合于抗原并免疫识别抗原，使得CAR至抗原的结合引发免疫应答。
[0025] 本发明的CAR对CD22具有抗原特异性。CD22为属于免疫球蛋白（Ig)超家族的 谱系限制的B细胞抗原。CD22在60-70%的B细胞淋巴瘤和白血病（如，B-慢性淋巴细胞 白血病、多毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病（ALL)和伯基特（Burkitt' s)淋巴瘤）中 表达并且不存在于B细胞形成早期阶段的细胞表面上或干细胞上。Vaickus等，Grit. Rev. Oncol. /HematoL, 11:267-297 (1991) ;Bang 等，Clin. Cancer Res.，11:1545-50 (2005) 〇
[0026] 不受特定理论或机制的束缚，据信通过引发对CD22的抗原特异性应答，本发明的 CAR提供下述中的任何一种或多种：靶向并破坏表达CD22的癌细胞、减少或消除癌细胞、促 进免疫细胞浸润至肿瘤位点以及增强/延伸抗癌应答。因为CD22不在B细胞形成早期阶 段或干细胞上表达，所以预期本发明的CAR大体上有利地避免靶向/破坏干细胞和/或早 期形成阶段的B细胞。
[0027] 本发明的实施方案提供包含m971抗体（〃m971〃）的抗原结合结构域的CAR。m971 的抗原结合结构域特异性地结合于CD22。在这方面，本发明的优选实施方案提供包含抗 原结合结构域的CAR，所述抗原结合结构域包含m971的抗原结合结构域的单链可变片段 (scFv)，由m971的抗原结合结构域的单链可变片段（scFv)组成，或基本上由m971的抗原 结合结构域的单链可变片段（scFv)组成。与HA22免疫毒素相比，m971抗体提供至⑶22的 改善结合并且还结合于不同的CD22表位。Xiao等，mAbsl: 3, 297-303(2009)。
[0028] 抗原结合结构域可包含轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的实施方案中， 重链可变区包含⑶Rl区、⑶R2区和⑶R3区。在这方面，抗原结合结构域可包含以下中的 一种或多种：含有SEQ ID NO: 1的重链⑶Rl区；含有SEQ ID NO:2的重链⑶R2区；和含有 SEQ ID N0:3的重链CDR3区。优选地，重链包含全部SEQ ID N0:l-3。
[0029] 在本发明的实施方案中，轻链可变区可包含轻链CDRl区、轻链CDR2区和轻链CDR3 区。在这方面，抗原结合结构域可包含以下中的一种或多种：含有SEQ ID N0:4的轻链⑶Rl 区；包含SEQ ID NO: 5的轻链CDR2区；和包含SEQ ID NO:6的轻链CDR3区。优选地，轻 链包含全部SEQ ID N0:4-6。在特别优选的实施方案中，抗原结合结构域包含全部SEQ ID NO:1-6〇
[0030] 抗原结合结构域的轻链可变区可包含SEQ ID NO: 7,由SEQ ID NO: 7组成，或基本 上由SEQ ID N0:7组成。抗原结合结构域的重链可变区可包含SEQ ID N0:8,由SEQ ID N0:8 组成或基本上由SEQ ID N