一种携带抗Her2/CD3双特异性功能蛋白的人T细胞制备
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种双特异性抗体。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体：由两种抗体直接连接而成，目前常见的制备方法如下：参考文献 PNAS, 2013, 110(1) : 270-275.
[0003] 首先利用PCR制备双特异性抗体基因，再将此基因克隆到表达载体PRB199转化 到大肠杆菌菌株化21(ADE3)。细菌接种到含80yg/ml氯霉素的肉汤培养基中，在37°C 培养，至A600处吸光度达2.0。在培养基中加入0.ImM异丙基-e-D-硫代半乳糖巧（is oproP5d0 -D-1-thiogalactopyranoside)诱导重组双特异性抗体的表达，继续在37°C培 养化。菌液在2000g离屯、15分钟，收集细菌，并用TE50/20缓冲液[50mMTris(pH7. 5) and20mM邸TA]重悬细菌，储存于-70°C。使用大量TE50/20缓冲液洗漆细菌，制备包涵体 (Inclusionbodies)。随后，在包涵体中加入6Mguanidine-HCl和DET(dithioer}ftbitol) 进行变性，然后使用到复性缓冲液（0.1MTris，0.5Marginine-HCl，0.9mMoxidized glutathione,and2mM邸TA;pH10.3)进行100稀释，在4°C快速混合，随后在4°C解育 72h，使蛋白重新折叠。复性后，W1:10的比例加入0. 1MTris和0. 5M化Cl进行透析，重 复=次后进行过滤（0. 2ym)，随后进行金属离子亲和层析。随后，采用快速蛋白液相色谱仪 炬ioLogicDuoFlow10System;Bi〇-Rad)进行纯化，采用组氨酸标签融合蛋白质纯化柱分 离bscEGFRvIIIxCD3。上样速度恒流控制在2毫升/分钟，然后用0. 1MTris和0. 5M化C1 进行清洗，直到280nm液吸光度的洗出液为0。蛋白质是由咪挫逐步梯度洗脱，流速1毫升 /分钟。将该产物进行过柱（SartoriusStedimBiotech)处理，去掉分子量大于10000的 蛋白，用PBS透析，过滤除菌。测定浓度后使用SDS/PAGE进行银染鉴定。
[0004] 其中有一类叫双特异性T细胞连接子炬ispecific T-cell化gager，BiTE)，因其 一端特异性抗T细胞表达的CD3分子而得名。
[0005] 化r2单抗治疗；如Tras化zum油化erceptin)已在部分化r阳性的肿瘤治疗中取 得了一定的疗效，但由于效应性免疫细胞的缺失，单纯的抗体治疗肿瘤难W完全清楚残余 肿瘤细胞进而防止肿瘤复发。
【发明内容】
[0006] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双特异性抗体，用于 解决现有技术中的问题。本发明所提供的一种双特异性抗体由=部分组成；抗肿瘤抗原的 抗体段、连接段和抗人CD3分子的抗体段，通过肿瘤抗原抗体段连接肿瘤细胞，同时抗CD3 抗体段连接T淋己细胞，从而有效将效应性免疫细胞趋化到肿瘤局部，使机体更有效地发 挥抗肿瘤效应。
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双特异性抗体，所述 双特异性抗体包括第一抗体段和第二抗体段，所述第一抗体段为抗肿瘤抗原抗体段，第二 抗体段为抗人CD3分子抗体段。
[000引优选的，所述双特异性抗体为单链双特异性抗体。
[0009] 优选的，所述抗肿瘤抗原抗体段为抗化r2抗体。
[0010] 更优选的，所述抗化r2抗体的化氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，所述抗化r2 抗体的VH氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0011] 更优选的，所述抗化r2抗体的化核巧酸编码序列如SEQIDNo. 1所示，所述抗 化r2抗体的VH核巧酸编码序列如SEQIDNo. 3所示。
[0012] 更优选的，所述抗化r2抗体的化和VH之间通过连接段2连接，所述连接段2的 氨基酸序列选自SEQIDNo. 5-7中的一种。
[0013] 在本发明一实施例中，所述抗肿瘤抗原抗体段从N端到C端依次包括抗化r2抗体 的化、连接段2、抗化r2抗体的VH，其氨基酸序列如SEQIDNo. 21、23、25所示，核巧酸编码 序列如SEQIDNo. 20、22、24 所示。
[0014] 在本发明一实施例中，所述抗肿瘤抗原抗体段从N端到C端依次包括抗化r2抗体 的VH、连接段2、抗化r2抗体的化，其氨基酸序列如SEQIDNo. 27所示，核巧酸编码序列如 SEQIDNo. 26 所示。
[0015] 优选的，所述抗人CD3分子抗体段的化氨基酸序列如SEQIDNo. 9所示，所述抗 人CD3分子抗体段的VH氨基酸序列如SEQIDNo. 11所示。
[0016] 优选的，所述抗人CD3分子抗体段的化核巧酸编码序列如SEQIDNo. 8所示，所 述抗人CD3分子抗体段的VH核巧酸编码序列如SEQIDNo. 10所示。
[0017] 更优选的，所述抗人CD3分子抗体段的化和VH之间通过连接段3连接，所述连接 段3的氨基酸序列如SEQIDNo. 12所示。
[001引在本发明一实施例中，所述抗人CD3分子抗体段从N端到C端依次包括抗人CD3分 子抗体段的VH、连接段3、抗人CD3分子抗体段的化，其氨基酸序列如SEQIDNo. 29所示， 核巧酸编码序列如SEQIDNo. 28中第1-744位所示。
[0019] 更优选的，所述第一抗体段和第二抗体段之间通过连接段1连接。
[0020] 进一步优选的，所述连接段1的氨基酸序列如SEQIDNo. 13或SEQIDNo. 14所 /J、- o
[0021] 在本发明一实施例中，所述双特异性抗体从N端到C端依次包括第一抗体段、连 接段1、第二抗体段，其氨基酸序列如SEQIDNo. 31、33、35、37、39、41、43、45所示，核巧酸 编码序列分别如SEQIDNo. 30 第 1-1560 位、SEQIDNo. 32 第 1-1560 位、SEQIDNo. 34 第 1-1560 位、SEQIDNo. 36 第 1-1545 位、SEQIDNo. 38 第 1-1533 位、SEQIDNo. 40 第 1-1566 位、SEQIDNo. 42 第 1-1551 位、SEQIDNo. 44 第 1-1539 位所示。
[0022] 本发明第二方面提供一种多核巧酸，所述多核巧酸编码所述的双特异性抗体。
[0023] 本发明第=方面提供一种含有所述多核巧酸的构建体。
[0024] 优选的，所述构建体由所述多核巧酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
[00巧]更优选的，所述表达载体选自pGEM、祀LNS、pMSGV中的一种或多种的组合。
[0026] 本发明第四方面提供一种重组的宿主细胞，所述重组的宿主细胞含有所述的构建 体、或者染色体中整合有所述的多核巧酸。
[0027] 优选的，所述重组的宿主细胞由所述构建体转染到宿主细胞构建而成。
[002引优选的，所述宿主细胞为T细胞。
[0029] 本发明第五方面提供所述双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤；在适合表达 所述双特异性抗体的条件下，培养所述重组的宿主细胞，从而表达出所述的双特异性抗体， 纯化分离出所述的双特异性抗体。
[0030] 本发明第六方面提供所述双特异性抗体、多核巧酸、构建体、重组的宿主细胞在制 备或筛选治疗化r2阳性肿瘤药物上的用途。
[0031] 例如，人胃癌细胞株N87、人卵巢癌细胞株SKOV3、人乳腺癌细胞株S邸R3、BT474该 些是化r2阳性的，人白血病细胞株K562、人乳腺癌细胞株MDA231、MDA468、MCF3为化r阴 性的
[0032] 优选的，所述化r2阳性肿瘤选自人胃癌细胞株N87、人卵巢癌细胞株SKOV3、人乳 腺癌细胞株S邸R3、BT474中的一种或多种的组合。
[0033] 具体的，所述重组的宿主细胞在制备或筛选治疗化r2阳性肿瘤药物上的用途具 体为携带所述双特异性抗体基因的T细胞在制备或筛选过继转输治疗化r2阳性肿瘤药物 上的用途。
[0034] 本发明第走方面一种药物组合物，包括治疗有效量的所述双特异性抗体或重组的 宿主细胞。
[0035] 该种组合物W所述双特异性抗体为活性成分，加上本领域一种或多种药物可接受 的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。
[0036] 本发明发明人利用双特异性抗体原理，构建化r2肿瘤抗原和T细胞特异性的双特 异性抗体，利用过继转输的T细胞携带并体内持续表达该抗体蛋白，从而使该双特异性抗 体在体内发挥杀伤作用的同时，伴随足量的T效应细胞，更优化了效应发挥的效率。
[0037] 如上所述，本发明构建化r2肿瘤抗原和T细胞特异性的双特异性抗体，利用过继 转输的T细胞携带并体内持续表达该抗体蛋白，具有W下有益效果：
[003引 a)祀向性：制备携带针对化r2阳性肿瘤双特异性抗体的效应性T细胞，过继转输 体内治疗肿瘤祀向性更好。
[0039] b)有效性；双特异性抗体RNA基因电转入T细胞后，会W分泌的形式表达，在体内 更有利于结合肿瘤细胞表面抗原，将肿瘤细胞与T细胞拉近，从T细胞更有效发挥杀伤效 应。
[0040]C)安全性；双特异性抗体RNA基因电转入T细胞体内，过继转输该群基因修饰的 T细胞进入体内后，待效应发挥后基因会被及时清除，而不会像慢病毒转染那样在体内长期 存在，该样安全性更佳。
【附图说明】
[004U图1显示为轻链段huMAb4D5-5化和重链段huMAb4D5-5VH示意图。
[00创图2 (a)显示为本发明