一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程领域，具体地涉及一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交 瘤及其单克隆抗体与应用。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌（colorectalcancer,CRC)是西方国家最常见的实体瘤，约占恶性肿瘤 死亡率的10%。在美国结直肠癌居恶性肿瘤死因的第二位，每年大约有52, 000例结直肠癌 患者死亡。近年来，我国结直肠癌发病率也呈上升趋势，居第五位恶性死因。肝脏是结直肠 癌最常见的远处转移器官，结直肠癌患者在疾病过程约有一半会进展为肝转移，其中30% 的患者肝脏为惟一的转移部位，15~35%的结直肠癌患者初诊时发现同时性肝转移，20~ 25%的患者随后出现异时性肝转移。肝转移是结直肠癌常见死因，近一半以上患者会死于 肝转移。结直肠癌肝转移患者如果放弃治疗则预后极差，中位生存时间为6~12个月，尽管 经过全身化疗，但肝转移瘤无法切除患者的中位生存时间只有12~24个月，生存时间超过 5年者罕见，结直肠癌同时性或异时性肝转移一直是困扰临床医生的难题，如何尽早发现结 直肠癌肝转移，或在结直肠癌根治术后对于肝转移危险度进行评估，并指导术后治疗是目 前面临的重要挑战。对结直肠癌术后肝转移发生危险进行预测，有助于术后进行有针对性 的辅助治疗，从而提尚整体生存率。
[0003] 结直肠癌肝转移是一复杂而连续的过程，首先癌细胞从原发癌灶脱离，降解胞外 基质脱离原发灶进入门静脉，随后通过信号传导，在相关受体和因子的作用下到达肝脏，穿 出血管重新粘附，进而在肝脏形成新生血管、再增殖，最终使肝转移灶形成。在此过程中各 种粘附分子、血管新生因子、细胞外金属基质蛋白酶等都产生作用。目前临床上用以检测结 直肠癌肝转移灶的方法主要是通过B超、CT，MR和DSA等影像学手段，但对肝转移灶的检查 率仅为50~90%，而且对直径lcm以下的微小转移灶，很难做出明确的诊断，术中探查虽也 可发现一些早期结直肠癌肝转移病灶，但当转移病灶直径小于4_时，探查发现率大为降 低。早期因临床症状不典型，CEA，CA19-9等肿瘤标志物又缺乏特异性，诊断相对困难。无 论是结直肠癌初次确诊时即己发现的肝转移，抑或根治术后再发生的肝转移，确诊时仅有 1/4~1/3的肝转移灶局限于一叶肝脏，大多数已经累及两叶，并且为多发，难以手术切除。 因此，肝转移癌的早期正确诊断对指导治疗，改善预后非常重要。寻找有效且稳定的早期诊 断结直肠癌肝转移的生物学标志物，将对结直肠癌肝转移的临床诊断和治疗产生深远的 影响。
[0004] 翻译控制肿瘤蛋白（TCTP)，又称P21 (小鼠TCTP)、P23 (人TCTP)、Q23,是一类广泛 存在于动物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族，人类TPT1基因 编码的蛋白称fortilin，是一类新的抗凋亡蛋白质。最初认为TCTP是一类生长相关蛋白， 近年的研宄提示TCTP具有非常重要的生物学功能，包括调节细胞周期的进程和恶性转移、 钙结合蛋白、细胞外组胺释放蛋白、抗凋亡及抗疟疾作用等。TCTP能够增强细胞的转移能 力，在结肠癌肝转移病人血清中的含量显著升高。检测TCTP在血清中的表达量对于监控结 直肠癌的转移有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有结直肠癌肝转移检测技术所存在的不能 及时正确诊断的缺陷，提供一种分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 所述细胞株可分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述杂交瘤细胞株分泌的抗人翻译控制肿瘤蛋白单 克隆抗体。
[0007] 本发明的第三个目的是提供上述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的应用。
[0008] 本发明的第四个目的是提供含有上述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的免疫 检测试剂盒。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予实现的： 一种分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株MQ-ANTI-TCTP-1，其分 类命名为人翻译控制肿瘤蛋白（Hu-TCTP)单克隆抗体杂交瘤细胞，所述细胞株于2014年 10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9811，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0010] 上述杂交瘤细胞株的制备方法如下：取血清效价大于1 :104的BALB/c小鼠脾细 胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的人翻译控制肿瘤蛋白包被ELISA板进行 ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗人翻译控制肿瘤蛋白的杂交瘤细胞 株。
[0011] 由上述杂交瘤细胞株分泌获得的抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体；优选地，所 述单克隆抗体为IgGl型，轻链均为K链。
[0012] 所述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的制备方法：应用保藏编号为CGMCC No. 9811的杂交瘤细胞株以IX106/只的量注入石蜡预处理的8~10周龄的BALB/c雌性 小鼠腹腔，饲养观察10~14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ProteinG SepharoseFastFlow纯化单克隆抗体，并通过SepharoseS-200分子筛脱盐，PBS洗脱，以 SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。
[0013] 上述任意一种抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体在制备肿瘤诊断试剂中的应用； 优选地，所述肿瘤为结直肠癌。
[0014] 含有上述抗人翻译控制肿瘤蛋白单克隆抗体的免疫检测试剂盒，所述免疫检测试 剂盒还含有标记物，所述标记物为荧光标记物、放射性标记物或酶标记物。
[0015] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、化学发光、 western-blot、免疫荧光以及组织的免疫组织化学检测的抗人翻译控制肿瘤蛋白（TCTP) 单克隆抗体。
[0016] 本发明中人翻译控制肿瘤蛋白（TCTP)的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 目前尚未有国产化的TCTP的抗体，国外有一些公司比如NovusBiologicals等有可以 检测TCTP的抗体产品，尽管可以用于免疫组化、ELISA、Westernblot等实验，但是抗体的 价格通常较昂贵，此外，像Abeam抗体以多抗居多，虽然特异性尚可，但是效价较低，另外一 些公司的抗体产品，与重组表达蛋白结合效果尚可，但是与天然TCTP蛋白反应效果不佳。 因此限制了该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研宄进展。
[0018] 本发明以重组人翻译控制肿瘤蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的 阳性，并用此纯化抗体对结直癌细胞SW480和Lovo进行Western-blot证明该抗体可以识 别天然变性的人翻译控制肿瘤蛋白。
[0019] 本发明将此纯化抗体用于进行结直癌细胞Lovo的免疫荧光染色以及肝癌组织的 免疫组化染色证明其能识别天然的人翻译控制肿瘤蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗 体为进一步研宄人人翻译控制肿瘤蛋白的功能和开发人人翻译控制肿瘤蛋白的临床诊断 试剂奠定了基础，为其作为肿瘤临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。
[0020] 本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达人翻译控制肿瘤蛋白全长蛋白，其 氨基酸序列为NP_003286. 1，全长172个氨基酸。与国外现有抗体相比，应用成本较低，能够 适用于ELISA，Westernblot、等各种蛋白检测实验，本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合， 还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。该抗体的 应用将为人翻译控制肿瘤蛋白功能研宄和其作为结直肠癌肿瘤肝转移标志物的临床标本 验证工作提供支持。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明单抗A1亚型鉴定结果。
[0022] 图2是本发明单抗A1对结直癌细胞SW480和Lovo免疫印迹的结果以及阴性对照 结果，其结合条带的分子量为23kDa附近。
[0023] 图3是本发明单抗A1对结直癌细胞SW480和Lovo免疫荧光染色的结果以及普通 光镜下的对照结果（显微镜放大倍数200倍）。
[0024] 图4是本发明单抗A1对肝癌组织免疫组织化学染色的结果以及阴性对照结果 (显微镜放大倍数100倍）。
【具体实施方式】 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明的思 路，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的 本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0026] 实施例1杂交瘤细胞株的制备 1、重组人翻译控制肿瘤蛋白抗原制备：从结直肠癌细胞Lovo中调取TCTP基因构建 原核重组表达载体pET22b(+)/TCTP，在大肠杆菌EscherichiacoliBL21中表达，利用Ni S印harose亲和层析纯化柱进行纯化，获得纯度达90%以上的重组人TCTP蛋白（TCTP蛋白 的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示）。
[0027] 其中，扩增人翻译控制肿瘤蛋白（TCTP)基因的引物序列为： 上游引物：5'-GTCGGATCCATGATTATCTACCGG-3'（SEQIDN0:2); 下游引物：5'-TTGCGGCCGCTTAACAmTTCCAITTCTAAACCA-3'（SEQIDN0:3); 其中，上游引入BamHI内切酶位点，下游引入NotI内切酶位点。
[0028] 2、小鼠免疫：取纯化的TCTP重组蛋白与250y1Bentonite佐剂混合，以 100yg/500y1的量腹部皮下多点注射BALB/c小鼠，间隔三周以1100yg/500y1的量腹部 皮下多点注射BALB/c小鼠，从第三次免疫开始，每次免疫后的第二周尾静脉采集小鼠血， 间接ELISA方法检测血清效价达到1:50000以上后准备融合，融合前3天，尾静脉注射加强 免疫一次，抗原剂量100yg。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。
[0029] 3、免疫血清效价测定：采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取30ygTCTP重组 蛋白溶解于l〇ml0. 05MpH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C过 夜。次日，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，用10mMPBS含10%新生牛血 清封闭液200y1/孔，37°C封闭lh，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，小鼠 于第三次免疫后15天尾静脉采血，鼠免疫血清用含2 %新生牛血清10mMPBS以KL1~10 _8 倍稀释，加入96孔板