用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9878的核酸序列及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测除草剂耐受性玉米植物DBN9878的核酸序列及其检测 方法，特别是涉及一种耐受草甘膦和草铵膦的玉米植物DBN9878和检测生物样品中是否包 含特定转基因玉米事件DBN9878的DNA分子的方法。
【背景技术】
[0002]N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘膦，是一种内吸传导型慢性广谱灭生性除草剂。草 甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS)的合成底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP) 的竞争性抑制剂，可抑制PEP和3-磷酸莽草酸这两种底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮 酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的转化，从而阻断芳香族氨基酸合成前体-莽草酸的合成途径，使 蛋白质的合成受到干扰导致植物和细菌死亡。
[0003] 草甘膦耐受性可以通过表达修饰的EPSPS来实现。修饰的EPSPS对草甘膦具有更 低的亲和性，因而在草甘膦存在的情况下，EPSPS保持了它们的催化活性，即获得了草甘膦 耐受性。
[0004] 玉米（ZeamaysL.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。在玉米生产中除草 剂耐受性是一项重要的农艺性状，特别是对草甘膦除草剂的耐受性。玉米对草甘膦除草剂 的耐受性可以通过转基因的方法使草甘膦除草剂耐受型基因（EPSPS，CP4)在玉米植物中 表达而获得，例如玉米事件NK603、玉米事件M0N88017等。
[0005] 草甘膦耐受性耕种系统的普遍采用和草甘膦使用的日益增加已经导致近年来草 甘膦抗性杂草的流行。在种植者面对草甘膦抗性杂草或向更难以控制的杂草物种转变的地 区，种植者可以通过与能够控制遗漏杂草的其它除草剂混合或交替使用来补偿草甘膦的弱 点。
[0006] 草铵膦是膦丝菌素类除草剂中的一种非系统性、非选择性除草剂。主要用于一年 生或多年生阔叶杂草的出土后控制，是通过L-膦丝菌素（草铵膦中的活性成分）对谷氨酰 胺合酶（一种对于植物中的氨解毒必需的酶）的不可逆抑制来控制杂草的。与草甘膦杀根 不同，草铵膦先杀叶，通过植物蒸腾作用可以在植物木质部进行传导，其速效性间于百草枯 和草甘膦之间。
[0007] 从链霉菌分离的酶膦丝菌素N-乙酰基转移酶（PAT)通过乙酰化催化L-膦丝菌素 转化为其无活性形式。表达PAT的植物优化形式的基因已经在大豆中使用以赋予大豆对 草铵膦除草剂的耐受性，例如大豆事件A5547-127。因此与草铵膦耐受性性状组合使用草铵 膦除草剂可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的非选择性手段。
[0008] 同时，随着转基因抗虫玉米大面积种植，少量存活下来的昆虫/害虫经过几代繁 殖后，可能产生抗性。抗除草剂转基因玉米作为非抗虫转基因玉米，与转基因抗虫玉米以一 定比例一并种植，可以延缓昆虫/害虫产生抗药性。
[0009] 已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色 质结构（如异染色质）或转录调节元件（如增强子）接近整合位点。为此，通常需要筛选大 量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件（即导入的目标基因得到最优表达的事件）。 例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在 表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在 差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所 预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选 出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因 表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其 他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用 这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地 的生长条件。
[0010] 能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。 此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投 入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因 的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应（PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检 测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的 转基因DNA相邻的染色体DNA( "侧翼DNA"）的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于 区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插 入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说 是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种用于检测除草剂耐受性玉米植物DBN9878的核酸序列 及其检测方法，转基因玉米事件DBN9878对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有较好的耐受 性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件DBN9878的 DNA分子。
[0012] 为实现上述目的，本发明提供了一种核酸序列，包括SEQIDNO:3或其互补序列中 至少11个连续的核苷酸、和/或SEQIDNO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。
[0013] 优选地，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 1或其互补序列、和/或SEQ ID NO: 2或其 互补序列。
[0014] 进一步地，所述核酸序列包括SEQIDN0:3或其互补序列、和/或SEQIDN0:4或 其互补序列。
[0015] 更进一步地，所述核酸序列包括SEQID NO:5或其互补序列。
[0016] 所述SEQIDNO: 1或其互补序列为转基因玉米事件DBN9878中在插入序列的5' 末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQIDN0:1或其互补 序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5'末端的DNA序列，包含所 述SEQIDN0:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9878的存在。所述SEQID N0:2或其互补序列为转基因玉米事件DBN9878中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQIDN0:2或其互补序列跨越了插入序列的 3'末端的DNA序列和玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQIDNO: 2或其互 补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9878的存在。
[0017] 本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQIDN0:3或其互补序列中转基因插入序 列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸（第一核酸序列），或者为所述SEQID NO: 3或其互补序列中5'侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续 多核苷酸（第二核酸序列）。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述 SEQIDNO: 1的所述SEQIDN0:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时， 这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA 扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQIDNO: 1的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件 DBN9878或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组 成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板 的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自5￡〇10勵：1、5￡〇10 N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4 和SEQIDN0:5 中所述的核苷酸。当选自SEQIDN0:3、 SEQIDN0:4和SEQIDN0:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21 个到大约50个或更多的连续核苷酸。所述SEQIDN0:3或其互补序列为转基因玉米事件 DBN9878中在插入序列的5'末端位于插入接合部位附近的一个长度为1411个核苷酸的序 列，所述SEQIDNO: 3或其互补序列由1120个核苷酸的玉米侧翼基因组DNA序列（SEQID NO: