一种应用blu-v pma技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法
【技术领域】
[0001]本发明一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，属于微生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002]副结核病(Para tuberculosi5.)是由副结核分枝杆菌，即鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobac teriUtm viumsubsp.Para tuberculosis, MAP)引起的一种以反合动物为主的慢性消耗性传染病，也称Johne, s病。该病很难净化，而且与人类的克罗恩氏(Crohn, s)病存在潜在的联系，有研宄表明人的这种严重的疾病可能是由于奶的巴氏消毒法不能够完全杀灭该菌，且研宄中发现几乎44%的奶制品中都检出副结核菌为阳性。随着我国国民生活水平的不断提高，牛奶需求量呈正指数增长，急需大量的优质、高产奶牛，促使近年来进口种牛骤增，迫切需要建立早期的快速、准确的副结核病诊断方法，以预防、净化和根除该病，保护我国畜牧业的健康快速发展。
[0003]目前检测副结核分枝杆菌的常见方法有细菌学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断。其中涂片镜检法不能鉴别出感染者体内的病原菌是否存活，细菌培养法存在难于培养且耗时长至少4-6周，药敏试验也耗时比较长的问题。补体结合实验(CF)虽然对有临床症状的病畜检出率较高，但用于潜伏感染病例时效果不佳。琼脂扩散试验(AGID)方法敏感性低，不宜用作筛选和鉴定亚临床感染病例。酶联免疫吸附试验(ELISA)比较敏感，有希望作为常用的诊断法。近几年，Nogva等人应用EMA-PCR技术来区分活菌和死菌。但是EMA具有一定的毒性，如果与细胞作用时间稍长就会嵌入活细胞的细胞膜与其DNA结合，从而影响，检测结果。单叠氮丙啶(propidium mono azide, PMA)能够通过细胞膜破损的死菌，与DNA结合，使死菌DNA在PCR时不再扩增，进而检测活菌的信号。TomasGarcia-Cayuela[53]等利用PMA_qPCR方法对乳制品中的四种乳酸菌进行了定量检测，PMA-PCR技术是目前最具应用前景的活菌检测技术。目前未有人应用BLU-V PMA结合荧光定量PCR技术进行副结核分支杆菌的存活性的快速判定。
[0004]然而，光源类型也是影响PMA处理的一个重要因素，在以往实验中对PMA进行处理时，所使用的光源都是600W的卤素灯，虽然其造价合理，照明度充分，但是它达到峰值亮度的时间短，且受到空气介质和样品浊度的影响，都会使PMA的处理效果降低，导致试验出现假阳性和假阴性的结果。
【发明内容】
[0005]本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中，结合荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中；
所述的将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法包括如下步骤:
a取待测样品，液体样品直接离心，固体样品加蒸馏水溶解离心，14500r离心5min ;离心完毕后，弃去上清，加入EBBufTer于沉淀中，混匀得菌悬液；
b向步骤a的菌液中加单叠氮丙啶，使单叠氮丙啶的终浓度为10yg/mL，充分混勾，并设不加PMA的菌悬液作为对照；将EP管置于避光盒中，避光1min ;取出EP管，将其放入BLU-V系统中(仪器的光强为100)，作用20min，使PMA与死菌的DNA双链结合；每隔2min取出EP管在漩涡振荡仪上振荡混悬一次，以增加结合率；
c步骤b结束后，取出EP管，14500r离心5min ;离心完毕后，弃去上清(注意要弃充分)；最后加入400 μ L的TE，再次重悬混匀；后续进行常规的DNA提取；
d以步骤c中提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR检测样品中的目标菌，上下游引物及探针序列分别为
上游:5，-AACGAGGGGACGATGAGG-Y 下游:5’ -CTGTGATGTAACGCGATTCG-3’
探针 5’ -FAM-CACGGCGTTGCTGATGTCCACC-TAMRA
荧光定量 PCR 反应体系为 10XPCRBuffer500mM, Kcl, lOOmMTris-cl (pH8.3)室温下2.5 yL, Mgcl225mMl.5 μ L，dATP, dCTP, dTTP, dGTP 各 3.2 ymol2.0 μ L，上下游引物 1pmol各 1.0 μ L，TaqDNA 酶 5U/ μ L2.5 yL，探针 3pmoll.0 yL，模板 DNA2.0 yL,ddH2011.5 yL，总反应体系25.0yLo
[0007]所述的一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，荧光定量PCR反应条件:93°C变性15s ;56°C退火15s，68°C延伸30s，40个循环。
[0008]所述的一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，确定TaqMan荧光定量PCR检测的Ct值< 25时，结果判定为阳性；与未经PMA处理组相比，PMA处理后的Ct值比未经PMA处的Ct值要大于6个以上，判定奶样中不含有活菌。
[0009]与现有技术相比本发明具有以下有益效果。
[0010]与以往PMA进行处理时所使用的光源都600W的卤素灯相比，而本发明所使用的BLU-V系统是一种能够持续生成稳定光刺激量的激光热稳定设备，即该设备具有特定的波长和持续稳定的激光照射强度，它可以将检测样品置于密闭空间中同时对12份经过PMA处理的样本进行光化激活反应。不仅避免了空气介质及样品浊度的影响，而且提高了样品检测的效率。
[0011]本发明使用BLU-V系统，结合PMA和荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中姻巧舌菌的方法。该方法操作简单，快速且比较精确。并使之成为奶及奶制品是否符合生物安全的一个重要指标，对预防、净化和清除该病，保护我国人民生命安全与畜牧业的健康快速发展具有重要的意义。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1中的荧光定量扩增图谱；
图2实施例2中不同光照时间处理所对应的荧光定量ct值；
图3实施例2中不同质量浓度PMA处理所对应的荧光定量ct值；
图4实施例3经PMA处理及无PMA处理的MAP标准菌株P18荧光定量扩增图谱；
图5实施例3经PMA处理及无PMA处理的MAP标准菌株P18荧光定量Ct值报告；
图6实施例3经PMA处理及无PMA处理的MAP标准菌株PlO荧光定量扩增图谱；
图7实施例3经PMA处理及无PMA处理的MAP标准菌株PlO荧光定量Ct值报告。
【具体实施方式】
[0013]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0014]实施例1
引物特异性验证
提取Map (P10和P18)、金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，草分枝杆菌6种标准菌株基因组DNA，进行TaqMan荧光定量PCR扩增，检测本发明方法的特异性。(副结核分枝杆菌(JiparaiMercWo1Si1S)标准菌株:P18 (美国)，P10 (日本)(都为牛型副结核标准菌株)，均由吉林兽医研宄所提供。金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，草分枝杆菌均由山西出入境检验检疫局技术中心实验室保存。)
1.DNA的制备
取50 μ L菌液，加入400 UL TE中，混匀。提取DNA模板的具体步骤如下:
(1)80°0水浴加热20 min，冷却至室温，使之灭活；
(2)加50y L溶菌酶，37 °C气浴震荡培养I h;
(3)加75yL SDS/蛋白酶K，混匀，65 °〇水浴加热10 min ；
(4)加100 yL 5 mol/L 的 Nacl 和 100 μ L 65 °C 预热 5 min 的 CTAB/Nacl，上下颠倒混匀，直至液体变为白色(奶状)，65 °0水浴加热10 min ；
(5)加750UL三氯甲烷:异戊醇(24: 1)，混匀，12000 r/min，室温离心5 min ;
(6)取上层水相(上清)于新管中，加等体积的三氯甲烷:异戊醇(24: 1)，混匀，12000r/min，室温离心5 min ；
(7)取上层水相于新管中，小心加入0.6体积的异丙醇，沉淀核酸，小手摇混匀，-20 0C放置 30 min，12000 r/min，室温离心 15 min ；
(8)弃上清，加入500μ L预冷的70%的乙醇，12000 r/min，室温离心5 min,；
(9)小心吸走液体，室温下干燥10min左右，用50 yL TE溶解，4 °C保存。
[0015]2.TaqMan荧光定量PCR反应体系及循环条件
荧光定量 PCR 反应体系为 10XPCRBuffer500mM, Kcl, lOOmMTris-cl (pH8.3)室温下2.5 yL, Mgcl225mMl.5 μ L，dATP, dCTP, dTTP, dGTP 各 3.2 ymol2.0 μ L，上下游引物 1pmol各 1.0 μ