用于活体外测定致肥胖风险的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测致肥胖风险的方法，尤指利用多个特定基因的单一核苷酸多 型性于活体外测定致肥胖的风险的方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪细胞在生物体一开始会以前趋脂肪细胞（pre-adipocyte)的形式存在，在体 内能量过多时，会促使前趋脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞（matureadipocyte),并将油脂 储存在脂肪细胞内。当能量持续过剩时，脂肪细胞会不断累积油脂，造成脂肪细胞肥大，演 变成肥胖。
[0003]过氧化体增殖剂活化受体（Peroxisomeproliferator-activated rec印tors，PPARs)是细胞核内受体蛋白的一类，主要作为转录因子调控核内基因的表达。 PPARs基因家族成员包含PPARA、PPARB及PPARG，其中PPARG有2种异构体（isoform): PPARG1及PPARG2。PPARG1在大部分组织都会存在（肌肉组织除外），PPARG2则仅表现在 脂肪组织及肠组织中。PPARG2基因其中一项主要功能便是调控脂肪生成的过程，尤其在前 趋脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞的阶段。在PPARG2基因小鼠剔除实验中，可以发现即使喂 食高油脂饲料，小鼠无法产生脂肪细胞。
[0004]PPARG基因多形性的研究中，SNPrsl801282(C-G)是许多学者热门研究的位点， 其变异会导致产生出来的PPARG2转录因子在第12号的氨基酸由脯氨酸（Proline)改变成 丙氨酸（Alanine)。此变异的已经改变PPARG2本身的蛋白结构，影响调控下游基因转录的 活性，然而rsl801282与肥胖的关联性目前有正反两面的看法。有一部分学者认为第12号 的丙氨酸会降低PPARG调控下游基因转录的活性，使脂肪组织较不易累积在体内降低，较 不易肥胖。但有另一部分的学者却从流行病学的调查中发现第12号氨基酸位置带有丙氨 酸的人，其BMI显著高于带脯氨酸的人。rsl801282与肥胖的关联性推测可能因人种间的差 异性而有所不同。
[0005]多配体蛋白聚糖（syndecan,SDC)是一种硫酸肝素蛋白聚糖（heparansulfate proteoglycan,HSPG),主要由核心蛋白（coreprotein)及硫酸肝素聚糖链（heparin sulfatechain)两个部分所组成。SDC基因家族主要存在于细胞膜上，由4个成员组成 (SDC1~SDC4)，其中多配体蛋白聚糖3(syndecan3,SDC3)主要表现于神经系统，包含控制 食欲的下视丘。在正常小鼠禁食实验中，发现禁食状态下大脑下视丘神经细胞SDC3基因 表有显著上升，推测此时SDC3可能是Agouti相关肽（Agouti-relatedpeptide,AGRP)的 共同受体，并通过AGRP结合褪黑素受体（melanocortinreceptor)传递增加食欲的信号， 促进摄食行为。当给予喂食时，SDC3膜外结构（ectodomain)会脱离细胞膜使a黑色素刺 激荷尔蒙（a-MSH)可与褪黑素受体结合传递抑制食欲的信号。观察SDC3基因剔除小鼠 (SDC3nullmice)的性状也发现其脂肪量低于正常小鼠，且摄食量下降，能量消耗上升，推 论SDC3基因可以调节体重及身体能量的平衡。然而，在针对欧洲人种的研究结果发现SDC3 的变异与肥胖发生无显著相关，再者，各个SDC3的SNP位点与肥胖发生的关联性有所不同。
[0006] 基于上述可见，若欲单独以PPARG或SDC3基因多型性作为肥胖基因指标恐仍有争 议之处，特定而言，单独利用PPARG或SDC3基因多型性检测致肥胖风险恐仍有不准确的疑 虑。
【发明内容】
[0007] 有鉴于现有技术检测致肥胖风险的方法，仍有检测结果不准确的问题，本发明的 目的在于提供一种具有提高准确率的检测致肥胖风险的方法。
[0008] 为了达上述目的，本发明提供一种用于活体外测定致肥胖风险的方法，其利用 PPARG与SDC3基因的基因型组合判定致肥胖的风险，而具有相比于单一基因的基因型，可 增加预测的准确度，以降低不同个体仅由相同的特定单一基因判定致肥胖风险的产生错误 的可能性，并可供用于作为提供对应保健对策的依据。
[0009] 在一方面，本发明提供一种用于活体外测定致肥胖风险的方法包括下列步骤：
[0010] 齐备一含核酸的样品，
[0011] 侦测该样品的过氧化体增殖剂活化受体（Peroxisomeproliferator-activated receptor,PPARG)与多配体蛋白聚糖3 (syndecan3，SDC3)的对偶基因的基因型，以及，
[0012] 鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型，取得一鉴别结果，该鉴别结果是 PPARG与SDC3对偶基因同时变异，则该样品为源自于一具有增加的致肥胖风险的个体。
[0013] 另一方面，本发明提供一种测定致肥胖风险的基因多型性标记，其是由PPARG与 SDC3基因型所形成的组合。
[0014] 依据本发明，所述的变异是例如，但不限于：核苷酸重复、核苷酸插入、核苷酸缺 失、复本变异或单一核苷酸多型性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)，所述的变 异造成插入子（intron)的序列变异、无义突变（nonsensemutation)或阅读框架位移 (readingframeshift)〇
[0015] 依据本发明，该含核酸的样品来自于一为亚洲人种的族群的个体；特定的，该个体 系汉人（HanChinese)。
[0016] 依据本发明，所述的核酸是脱氧核糖核酸或核糖核酸，优选的为基因组脱氧核糖 核酸（genomicDNA)。总所周知，当所述的核酸是核糖核酸时，齐备一含核酸的样品的步骤 包括，提供一核糖核酸，并且形成互补脱氧核糖核酸。
[0017] 依据本发明，所述的侦测PPARG与SDC3的对偶基因的基因型的步骤包括利用 本领域所知的任何以一般遗传工程、生物化学等方法鉴别PARG与SDC3的对偶基因的基 因型的技术，例如，但不限于：聚合酶链锁反应配合定序分析（PCRandSequencing)、即 时聚合酶链锁反应（Real-timePCR)、限制性片段长度多型性（restrictionfragment lengthpolymorphism,RFLP)、质谱仪分析（MassSpectrometry);或者，任何其他合适的 分析基因型的高通量筛选方法（high-throughputscreeningmethod),诸如配合连接子 聚合酶链锁反应（Linker-PCR)的生物晶片（Biochip)或次世代定序（Nextgeneration sequencing,NGS)〇
[0018] 依据本发明，所述的PPARG对偶基因的变异发生于外显子（exon)及内显子 (intron)区域内，所述的鉴别该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型包括：分析PPARG 与SDC3对偶基因的变异，以取得该鉴别结果，其中PPARG对偶基因的变异发生于选自于由 下列者所构成的群组的位置：rsl801282 (外显子4)、rsl805192 (外显子3)、rsl800571 (外 显子2)、rsl822825(内显子6);特别是发生于具有如SEQIDNO. 1所示序列的区域，该SNP rsl801282C-G对偶基因变异位在PPARG基因外显子区域内，使该基因转译后第12号氨基 酸由脯氨酸（Proline)变异成丙氨酸（Alanine)，改变蛋白质构形，影响PPARG转录活化功 能，或是发生于具有如SEQIDNO. 3所示序列的区域。
[0019] 依据本发明，所述的SDC3对偶基因的变异发生于外显子区域内，其中SDC3的变异 发生于选自于由下列者所构成的群组的位置：1'82282440、^2491132以及^4949184;特别 是具有如SEQIDN0. 2所示序列的区域内，该SNPrs2282440C-T对偶基因变异位在SDC3 基因外显子区域上，使该基因转译后第329号氨基酸由苏氨酸（Threonine)变异成异亮氨 酸（Isoleucine)〇
[0020] 依据本发明，所述的测定致肥胖风险的基因多型性标记，其是由PPARG的SNP rsl801282、rsl805192、rsl822825和 / 或rsl800571 ;与SDC3 的SNPrs2282440、rs2491132 和/或rs4949184所形成的组合。
[0021] 更佳的，侦测该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型的步骤包含：将该样品 与两不同专一性探针相结合，所述专一性探针是分别针对PPARG的SNPrsl801282,以及 SDC3的SNPrs2282440 ;以及，其中该鉴别结果是PPARG的rsl801282为G同时SDC3的 rs2282440为T，则该样品为源自于具有增加的致肥胖的风险的个体。
[0022] 更佳的，侦测该样品的PPARG与SDC3对偶基因的基因型的步骤包含：将该样品 与两不同专一性探针相结合，所述专一性探针是分别针对PPARG的SNPrsl822825,和针 对SDC3的SNPrs2282440 ;以及，其中该鉴别结果是PPARG的rsl822825为G同时SDC3的 rs2282440为T，则该样品为源自于具有增加的致肥胖的风险的个体。
[0023] 所述的PPARG对偶基因的变异发生于具有如SEQIDNO. 1所示序列的区域，优选 的，该序列的第26碱基位置为G。
[0024] 所述的PPARG对偶基因的变异发生于具有如SEQIDN0. 3所示序列的区域，优选 的，该序列的第26碱基位置为G。
[0025] 所述的SDC3对偶基因的变异发生于具有如SEQIDN0. 2所示序列，优选的，该序 列的第26碱基位置为T。
[0026] 依据本发明，所述的肥胖以选自于下列所构成的群组的数值为指标：个体的身体 质量指数（bodymassindex,BMI)、腰围、腰臀比、体脂率，以及血液中三酸甘油酯含量。
[0027] 依据本发明，所述的个体的身体质量指数，如本领域所知的，是体重（公斤）/身高 2(公尺2)。
[0028] 依据本发明，所述的腰围为任何本领域所接受的方式进行量测所得到的数值，优 选的是指除去腰部覆盖的衣物，轻松站立，双手自然下垂，将皮尺绕过腰部，调整高度，让皮 尺能通过左右两侧骨盆上缘(肠骨上缘）至肋骨下缘的中间，注意皮尺与地面保持平行，并 紧贴、不挤压皮肤，维持正常呼吸，在吐气结束时，量取的腰围数值。
[0029] 依据本发明，所述的腰臀比（WaisttoHipRatio,WHR)是指腰围和臀围的比例， 数值等于腰围除以臀围，其中腰围如前所述，而臀围指在双腿并拢时以水平最大宽度处的 量度值。一般而言，腰围反映脂肪总量和脂肪分布的综合指标，臀围反映髋部骨胳和肌肉的 发育情况。腰臀比越大时，表示倾向于肥胖。
[0030] 依据本发明，前述的指标可以以一般正常人为基准，定义所述的肥胖，优选的，当 个体的身体质量指数（bodymassindex,BMI) 3 27公斤/公尺2、腰围男性3 90公分，女 性兰80公分、腰臀比男性兰0.9,女性兰0.85、体脂率男性兰30%，女性兰35%，为所认定的 肥胖。
[0031] 依据本发明的方法其进一步包括：记录该鉴别结果于一记录媒体中。所述的方法 可以包括应用于与一记录媒体相配合，该记录媒体可为一云端硬盘、DVD、随身存取记忆体、 行动装置或任何其他可记录资讯或连结一运算软件或工作站的媒介。
[0032] 基于上述，本发明的方法与标记，可通过同时检测SDC3与PPARG的基因型相比于 单纯仅试验SDC3或PPA