一种利用pcr扩增后直接dna测序筛查肝豆状核变性致病基因突变位点的方法

文档序号:8509068阅读:1238来源:国知局
一种利用pcr扩增后直接dna测序筛查肝豆状核变性致病基因突变位点的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种通过对聚合酶链式反应(PCR)产物直 接测序确定ATP7B基因突变位点的方法。 技术背景
[0002] 肝豆状核变性,又称Wilson病(Wilson,sDisease,WD),是一种铜代谢障碍的常 染色体隐性遗传性疾病。国外流行病学调查资料显示,其患病率为1. 5-3. 0/10万,基因频 率为0. 3%-0. 7%,杂合子频率估计为1/100。该病在我国尚无大宗资料的流行病学报告,根 据相关报道,Wilson病居全部单基因遗传病的第二位。
[0003] 对Wilson病诊断常常通过血浆铜蓝蛋白,血铜、尿铜含量,K-F环等指标来判断, 但W)病人中仅有80%病人表现为血浆铜蓝蛋白偏低,30-40%的病人有K-F环出现,漏诊和 误诊时有发生,错过最佳治疗时期,对病人造成不同程度的不可逆损害。随着分子生物技术 的发展及疾病致病机理研宄的深入,已经发现ATP7B基因突变是导致Wilson病的根本原 因。因此通过基因检测,筛查ATP7B基因上是否存在致病突变,对于Wilson病的精确诊断 具有重要的意义,同时也为产前诊断、优生优育提供指导。
[0004]ATP7B基因(WND; 0MM#277900)位于13号染色体上,全长78826bp,包含21个外 显子和20个内含子序列,目前已发现500多个致病位点,突变类型包括错义突变、无义突 变、缺失和插入等。这些突变位点大多位于WD基因的所有外显子,也有分布在内含子剪切 区内和上游启动子序列。因此对所有外显子编码区域、内含子剪切区域及上游启动序列进 行测序分析,对于明确诊断具有重要的意义。
[0005] 由于全基因序列较长,全基因测序费用高,所需样本量大,准确率低,不被临床和 患者所接受。我们通过先PCR扩增出目的序列,对目标序列进行测序分析,大大降低了测序 成本,节省了检测时间,且该方法简单易行,准确率高,具有实际的临床应用价值,为临床确 诊提供依据。

【发明内容】

[0006] 本发明要解决的技术问题:为Wilson病提供一种成本较低、简便快捷、准确度高、 可操作性强的基因检测方法,降低因临床症状不明显而导致的漏诊与误诊的机率,同时可 辅助产前筛查,指导优生优育。
[0007] 本发明采用的技术方案: 一种利用PCR扩增后直接DNA测序方法筛查ATP7B基因突变的方法,该方法通过对外 周血基因组DNA中ATP7B基因目标区域进行扩增、测序和生物信息分析的方法,进而筛查出 导致肝豆状核变性疾病的基因突变位点。
[0008] 所述的方法主要包括以下步骤: (1)样本基因组DNA的提取 (2)引物设计 根据Genebank公布的人类ATP7B基因序列,设计23对引物,扩增ATP7B基因全部的21 个外显子、上游启动序列及部分内含子序列,所设计的23对引物序列如表1。
[0009] (3)PCR扩增将每对引物分别进行扩增,扩增体系如下:无菌水11W,0. 01ug/ml 的模板〇. 5W,10剛的正向引物0. 5W,10剛的反向引物0. 5W,1. 25U/25W的Pre-mix酶 12. 5m; (4) 凝胶电泳:扩增结束后取产物0. 5W进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳验证,然后在紫外 凝胶成像系统下进行观察并拍照; (5) 进行PCR产物纯化和测序、并对测序结果进行序列比对分析,判断是否存在致病突 变。
[0010]所述样本DNA的提取包括以下步骤: (1) 取全血50~100y1,加入至1. 5ml收集管中,用灭菌水补至200y1 ; (2) 加入180yl蛋白酶缓冲液、20yl蛋白酶K和10mg/ml的RNA抑制酶A10yl,充 分吸打混匀,于56 °C水浴10分钟,进行细胞裂解; (3) 向裂解液中加入200y1乙醇,充分吸打混匀; (4) 将吸附柱安置于收集管上,然后将步骤(3)中的溶液移至吸附柱中,8000rpm离心 2分钟,弃滤液; (5) 将500y1的冲洗液BufferWA加入至吸附柱中,8000rpm离心1分钟,弃滤液; (6) 将700y1的冲洗液BufferWB加入至吸附柱中,12000rpm离心1分钟,弃滤液; (7) 重复操作步骤(6),将吸附柱安置于收集管上,12000rpm离心2分钟; (8) 将吸附柱安置于新的1. 5ml离心管上,在吸附柱膜中央加入50~200y1的灭菌 水或洗脱液,室温静置5分钟;8000rpm离心2分钟洗脱DNA,得到DNA样本; (9) DNA的定量:提取得到的基因组DNA,通过分光光度计测定其吸光度并计算纯度。
[0011] 所述的方法PCR扩增时条件如下:95°C预变性5分钟,95°C变性30秒,55°C退火 30秒,72 °C延伸60秒,按变性、退火、延伸的顺序进行35个循环后,再72 °C延伸5分钟,得 到扩增产物,于4°C保存。
[0012] 所述电泳验证时的电压为100v,电泳时间为45min。
[0013]所述的引物序列在筛查肝豆状核变性基因突变中的应用。
[0014] 本发明的积极有益效果: 1、本发明的筛查肝豆状核变性基因突变方法采用PCR扩增后直接DNA测序的方法,与 传统测序方法相比,该方法简便快捷,得到的PCR产物能直接进行DNA序列分析,能够明确 突变位点,为检测基因突变提供了最可靠的方法,并且该方法所设计的引物灵敏度高,在人 基因组浓度低至1pmol时,仍能扩增出目标条带,显著提高了检测的灵敏度与准确性。
[0015] 2、本发明设计的引物在合适条件下扩增出的条带单一,无非特异性条带,具有较 好的特异性,为PCR产物的纯化回收创造了有利条件,降低测序成本。(从图1中可以明显 看出所扩增的单一条带)。
[0016]3、本发明通过对ATP7B基因全外显子及启动序列先进行PCR扩增,再测序,这样 检测位点明确,针对性强,大大提高了测序结果的准确性,降低检测成本。
[0017] 4、本发明的PCR引物设计合理、高效,特异性强、灵敏性高,利用该引物通过检测 外周血提取DNA进行体外扩增,得到所需的PCR产物,待直接测序后确定所测目标基因的多 态性,为肝豆状核变性疾病的临床诊断及优生优育提供了诊断依据。
【附图说明】
[0018] 图1本发明的23对引物所对应的扩增条带。
[0019] 图2本发明用软件对每对引物的测序结果。
[0020] 图3本发明对检测位点进行的结果比对图。
【具体实施方式】
[0021] 例1: 一种利用直接测序法筛查肝豆状核变性基因突变的方法,包括以下步骤: 1、外周血取样 用含有乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(简称EDTA)的抗凝管抽取待查的
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1