1,4-丁二醇的制造方法及微生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种1，4- 丁二醇（butanediol)的制造方法及微生物。
【背景技术】
[0002] 近年，从化石资源的枯渴和地球温暖化的应对等角度来看，以可再生资源为原料 的化合物制造工艺备受瞩目。特别是以生物量（biomass)为原料并采用生物化学工艺来制 造各种聚合物原料化合物和化学品原料化合物的所谓的"生物精练（biorefinery) "更受到 了广泛的关注。
[0003] 作为一种可向生物量进行原料转换的化合物，可列举出1，4-丁二醇。1，4-丁二醇 作为精密有机化学品的合成原料、绦纟仑（polyester)、及工程塑料（engineeringplastic) 的单体（monomer)单位等得到了广泛的应用，其市场规模也非常大。为此，急需一种可采用 以生物量等可再生资源为原料的生物化学工艺来高效制造1，4- 丁二醇的方法。
[0004] 作为采用生物化学工艺来制造1，4- 丁二醇的制造方法，例如，可列举出如下专利 文献1、2、及非专利文献1中所记载的方法。
[0005] [专利文献1]专利第4380704号说明书
[0006] [专利文献2]国际公开第2008/115840号公报
[0007][非专利文献l]HarryYimetal.，MetabolicengineeringofEscherichia colifordirectproductionof1，4-butanediol，NatureChemicalBiology? 7? 445-452(2011).
【发明内容】
[0008] [发明要解决的课题]
[0009] 然而，就上述专利文献1、2、及非专利文献1中所记载的方法而言，其工艺较为复 杂。
[0010] 针对上述课题，本发明提供一种可经济地获得1，4- 丁二醇的新颖的1，4- 丁二醇 的制造方法。
[0011] [用于解决课题的手段]
[0012] [1] 一种1，4-丁二醇的制造方法，其使用微生物和/或其培养物，并通过使用了酰 基CoA还原酵素（Acyl-CoAReductase(或称"酰基CoA还原酶")）的酵素反应系（reaction system)，依次经由 3-轻丁酰（hydroxybutyryl)CoA、巴豆酰（crotonyl)CoA、及 4-轻丁酰 CoA来制造1，4- 丁二醇，所述1，4- 丁二醇的制造方法的特征在于，
[0013] 所述酰基CoA还原酵素的针对4-羟丁酰CoA的反应性是针对3-羟丁酰CoA的反 应性的0.05倍以上。
[0014] [2]上述[1]中记载的1，4-丁二醇的制造方法，其中，所述酰基CoA还原酵素是醛 脱氢酶（aldehydedehydrogenase)(酰基化）（EC编号：1. 2. 1. 10) 〇
[0015][3]上述[1]中记载的1，4-丁二醇的制造方法，其中，所述微生物包括下述（a)~ (C)的任一个中所记载的、对所述酰基CoA还原酵素进行编码（code)的遗传基因：
[0016] (a)具有序列编号（sequencenumber)6的碱基序列（basesequence)的遗传基 因；
[0017] (b)具有喊基序列的遗传基因，该喊基序列是序列编号6的喊基序列中1个或多个 盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的碱基序列，并且，该碱基序列相对于序列 编号6的喊基序列具有90%以上的同一性；
[0018] (c)在渐快（stringendo)条件下，对具有序列编号6中所记载的碱基序列的遗传 基因和具有互补碱基序列的遗传基因进行杂交（hybridize)所得的遗传基因。
[0019] [4]上述[1]中记载的1，4_ 丁二醇的制造方法，其中，所述微生物是大肠杆菌、酵 母、棒状（coryneform)细菌、及梭菌属（clostridium)细菌。
[0020] [5] -种微生物，其用于通过使用了酰基CoA还原酵素的酵素反应系，依次经由 3- 羟丁酰CoA、巴豆酰CoA、及4-羟丁酰CoA来制造1，4- 丁二醇，所述微生物的特征在于，
[0021] 所述酰基CoA还原酵素的针对4-羟丁酰CoA的反应性相对于针对3-羟丁酰CoA 的反应性为0.05倍以上。
[0022] [6]上述[5]中记载的微生物，其中，所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状细菌、及 梭菌属细菌。
[0023][发明的效果]
[0024] 能够提供一种可经济地制造1，4-丁二醇的制造方法。
【附图说明】
[0025][图1]本实施方式的1，4-丁二醇的制造方法的酵素系的一例。
【具体实施方式】
[0026] 以下对本发明进行详细说明。这里需要说明的是，在本说明书中，「CoA」是指「辅 酶（coenzyme)A」的意思。另外，如果没有特别的说明，「％」是「质量％」的意思。「ppm」表 示质量基准。
[0027] 在本实施方式中，使用微生物，并利用酵素反应系，依次经由乙酰乙酰 (acetoacetyl)CoA、3_ 轻丁酰CoA、巴豆酰CoA、及 4-轻丁酰CoA来制造 1，4- 丁二醇。这 里，本发明的特征之一为，一种可选择性地并高生产性地制造1，4- 丁二醇的微生物或其培 养物的使用方法。
[0028] 本发明人对解决上述课题的技术手段进行了潜心研宄和锐意探索，并发现了一种 可制造1，4- 丁二醇的制造方法，其使用微生物并通过酵素反应系，以3-羟丁酰CoA为基 质（也可为中间体、前驱体等。），并依次经由巴豆酰CoA和4-羟丁酰CoA来制造1，4-丁 二醇，其中，通过适当选择对酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因，可具有更高的相对于 4- 轻丁酰CoA的反应选择性。据此，可抑制从3-羟基丁醋（hydroxybutyl)CoA向1，3- 丁 二醇的生成，并可提高1，4- 丁二醇的生产性。
[0029] 另外，在本发明的较佳实施方式中，还可提供一种制造1，4-丁二醇的制造方法的 方法，其通过适当选择对酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因，可使与4-羟丁酰CoA的 反应性相对于与3-羟丁酰CoA的反应性为至少0. 05倍以上。
[0030] 以下对本实施方式中所使用的微生物的特征、微生物的制作方法、微生物的使用 方法（即，1，4- 丁二醇的制造方法）、及所制造的1，4- 丁二醇的获取方法等进行说明。
[0031] (宿主微生物）
[0032] 本实施方式中所使用的宿主微生物是可导入后述各种遗传基因的宿主微生物，并 且，只要是可使用遗传基因改造（转基因）技术的宿主微生物即可，对其并无特别限制。
[0033] 具体而言，是一种可向以3-羟丁酰CoA为基质，依次经过巴豆酰CoA和4-羟丁 酰CoA，并在后述适当的培养条件下可生产1，4- 丁二醇的微生物进行形质转换的宿主微生 物。
[0034] 工业实用性的观点来看，作为具体例子，可列举出大肠杆菌、酵母、棒状细菌、及 梭菌属细菌。作为酵母，可列举出酿酒酵母（saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵 母（schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母（kluyveromyceslactis)、及马克 斯克鲁维酵母（kluyveromycesmarxianus)等。作为棒状细菌，可列举出谷氨酸棒杆菌 (corynebacteriumglutamicum)、有效棒杆菌（corynebacteriumefficiens)，双歧短杆 菌（brevibacteriumdivaricatum)，角军糖短杆菌(brevibacteriumsaccharolyticum)， brevibacteriumimmariophilum，乳糖发酵短杆菌（brevibacteriumlactofermentum)， 玫瑰色短杆菌（brevibacteriumroseum)，黄色短杆菌（brevibacteriumflavum)，硫 殖短杆菌（brevibacteriumthiogenitalis)，嗜乙酰乙酸棒杆菌（corynebacterium acetoacidophilum)，醋谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumacetoglutamicum)， corynebacteriumcallunae，百合棒杆菌（corynebacteriumlilium)，corynebacterium mellassecola，嗜氨小杆菌（microbacteriumammoniaphilum)等。作为梭菌属细菌，可列 举出克氏梭菌（clostridiumkluyveri)，丙酮丁醇梭菌（clostridiumacetobutylicum)， 氨基丁酸梭菌（clostridiumaminobutyricum)，拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii)， clostridiumsaccharoperbutylacetonicum等。其中，尽管常用的为大肠杆菌、酿酒酵母、 粟酒裂殖酵母、及谷氨酸棒杆菌，但是，为了容易地进行形质转换，优选使用大肠杆菌。
[0035] 另外，就本实施方式中的形质转换微生物而言，其也可以以微生物培养菌