Fuwa基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种FUWA基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是最重要的粮食作物之一，其养活了世界上近四分之一的人口。开展水稻遗 传与育种研究一直成为许多国家近年来的重点。随着近年来世界人口的持续增长和环境的 不断恶化，粮食产量增加却远远不能满足人类的需要。而作物产量形成遗传机制研究可以 促进高产分子育种研究。但截至目前，人们对作物产量的分子调控机制仍然知之甚少。
[0003] 水稻产量受到包括单位面积有效穗数、每穗粒数和千粒重三大因素影响，而千粒 重与水稻籽粒的粒形显著正相关。稻谷籽粒形状不仅是影响水稻产量的重要指标之一，也 是影响稻米的外观品质、商品品质和加工品质的重要因素。粒形在形成过程中受到植物激 素代谢及信号途径、植物发育和代谢途径以及表观遗传学途径等多种途径的调控，通过调 控植物组织的最终细胞数目以及碳、氮合成及运输使得种子最终形态得以形成。在水稻中， 粒形是受多基因控制的复杂数量性状，可分解为粒长、粒宽以及粒厚，并且他们分别受到不 同主效核基因的控制。
[0004] 世界各地的消费者对稻米大小和形状的要求各不相同。美国、法国及欧洲的消费 者喜欢细长粒形稻米；在亚洲，印度喜欢长粒米，东南亚则喜爱中等或偏长粒形的米粒，而 在温带地区却是短粒米较受欢迎。在中国，长江以北喜爱吃短粒形粳米，长江以南大部分地 区喜欢长粒形籼稻米。因此，研究稻米粒形的遗传机理对培育满足不同市场需求的优质水 稻品种具有重要指导意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种FUWA基因及其应用。
[0006] 本发明提供的一种蛋白，为如下（1)或（2)所示：
[0007] (1) SEQ ID No. 1 所示的蛋白；
[0008] (2)将SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0009] 所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0010] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
[0011] 1) SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子；
[0012] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0013] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。
[0014] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0015] -种干扰载体也属于本发明的保护范围，该载体是将SEQ ID No. 2中自5'末端第 965至1415位核苷酸所示的DNA片段插入pCUbil390- A FAD2载体的Kpn I酶切位点，得 到中间载体；将SEQ ID No. 2中自5'末端第965至1415位核苷酸所示的DNA片段的反向 互补序列插入中间载体的Pst I酶切位点，最终得到干扰载体。
[0016] 一种改变植物籽粒性状的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：使植物 上述蛋白的表达或活性被抑制、或植物中上述任一所述编码基因的表达被抑制，进而增加 植物籽粒的粒宽、粒厚和/或粒重，和/或减少植物籽粒的粒长。
[0017] 上述方法中，所述使植物上述蛋白的表达或活性被抑制、或植物中上述任一所述 编码基因的表达被抑制的方法包括如下步骤：将所述的干扰载体导入出发植物中，得到转 基因植物。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述植物为水稻。
[0019] 抑制上述蛋白的表达或活性的物质在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧凑、直立 程度和/或缩短粒长中的应用也属于本发明的保护范围；
[0020] 和 / 或，
[0021] 抑制上述任一所述的编码基因表达的物质在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧 凑、直立程度和/或缩短粒长中的应用也属于本发明的保护范围；
[0022] 所述植物具体为水稻。
[0023] 上述干扰载体在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧凑、直立程度和/或缩短粒长 中的应用也属于本发明的保护范围；
[0024] 所述植物具体为水稻。
[0025] 本发明的实验证明，与野生型水稻相比，FUWA基因表达抑制水稻的粒宽和粒厚显 著增加，粒长减少，粒重增加，穗型由原来的松散穗型改变为紧凑且直立的穗型。细胞学观 察表明FUWA基因表达抑制水稻的颖壳和穗基部横向细胞分裂显著增加。
[0026] 本发明对于进一步阐明植物花序和小花发育分子机理并通过基因工程手段培育 优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。
【附图说明】
[0027]图 1 为 pCUb i 1390- A FAD2 载体图谱。
[0028] 图2为野生型水稻Nipponbare与FUWA基因抑制表达水稻的表型。
[0029] 图3为野生型水稻Nipponbare与FUWA基因抑制表达水稻的粒长、粒宽、粒厚以及 千粒重统计数据。
[0030] 图4为转空载体水稻和FUWA基因抑制表达水稻的表型以及FUWA基因抑制表达检 测。
[0031] 图5为野生型水稻Nipponbare和FUWA基因抑制表达水稻的颖壳和穗基部横向细 胞增殖情况。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0035] N6 培养基购自美国 PhytoTechnology Laboratories，货号为 C167。
[0036]水稻品种 Nipponbare (Oryza sativa)在文献"Zhou, S.，Wang, Y.，Li, W.，Z hao, Z. , Ren, Y. , Wang, Y. , Gu, S. , Lin, Q. , Wang, D. , Jiang, L. , Su, N. , Zhang, X. , Liu, L .,Cheng, Z. , Lei, C. , Wang, J. , Guo, X. , ffu, F. , Ikehashi, H. , Wang, H. , &ffan, J. 2011. Pollen semi-sterilitylencodes a kinesin-1-like protein important for male meiosis, anther dehiscence, and fertility in rice. Plant Cell, 23 (1) : 111-129" 中公 开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0037]根癌农杆菌 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)在文献 ^Hood,Elizabeth E;Gelvin,Stanton B;Melchers,Leo S;Hoekema,Andre.1993. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research, 2(4) :p. 208-218-218"中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获 得。
[0038] pCUbi 1390- A FAD2 载体在文献 "Mao B.，et al. 2012. Wax crystal-sparse leaf2, a rice homologue of WAX2/GL1, is involved in synthesis of leaf cuticular wax. Planta，235:39 - 52"中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0039]实施例1、FUWA基因RNA干扰载体pCUbi 1390- A FAD2-FUWA的构建
[0040] 一、FUWA基因的获得
[0041] 提取野生型Nipponbare的总RNA并反转录为cDNA，以其cDNA为模板，以 FUWA-cds-F和FUWA-cds-R为引物进行PCR扩增，得到FUWA基因。FUWA蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No. 1所示，FUWA基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0042] 引物如下：
[0043] FUWA-cds-F: 5 ' -ATGGCCTCCCTCCTCCTCC-3 '
[0044] FUWA-cds-R: 5，-TCAGTACCTGTAGCCGCTGTCAG-3 '
[0045] 二、FUWA基因干扰片段的获得
[0046](一）提取野生型水稻Nipponbare的14天幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。
[0047](二)以步骤(一)得到的cDNA为模板，用FUWA-sense-F和FUWA-sense-R组成的引 物对进行PCR扩增，得到PCR产物。
[0048] 引物如下：
[0049] FUWA-sense-F:5' -TTACTTCTGCACTAGGTACCAACTTGTTATTGAAGGGGTGGG~3,；
[0050] FUWA-sense-R: 5 ' -TAGAGCTCAGGCCTGGTACCTCACTGTAGTCTGCGGGCTTC-3 '。
[0051] (下划线所示序列为Kpn I酶切识别位点）
[0052](三）以步骤（一）得到的 cDNA 为模板，用 FUWA-antisense-F 和 FUWA-antisense-R 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。
[0053] 引物如下：
[0054] FUWA-antisense-F:5' -TTGCTTTTGGTTTTCTGCAGTCACTGTAGTCTGCGGGCTTC~3,；
[0055] FUWA-antisense-R: 5' -CTGCACCCATGTTTCTGCAGAACTTGTTATTGAAGGGGTGGG~3,。 [0056](下划线所示序列为Pst I酶切识别位点）
[0057] 三、干扰载体的构建
[0058](一）用限制性内切酶Kpn I酶切pCUbi 1390- A FAD2载体，回收约12060bp的线 性质粒，得到载体大片段，pCUbil390- A FAD2环状载体图谱如图1所示。
[0059](二)Kpn I酶切步骤二的(二)得到的PCR产物，得到基因片段；将基因片段与步骤 (一）得到的载体大片段连接，得到重组质粒，记作pCUbil