在线工业鲁棒化调控细胞状态生产第八因子的装置与方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物工程领域中可在线调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置与方法，尤其涉及一种可在线工业鲁棒化(industrially robust)连续监控、连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统的细胞培养环境中各项理生化指标，并可直接在线调节和控制细胞状态的细胞培养、扩增和制备重组凝血八因子的方法。
【背景技术】
[0002]甲型血友病是一种伴性遗传疾病，人群中该病的总发病率为6人/每10万人，由于诊断方法的进步和医疗水平的提高，血友病发病率(统计数字)有明显的升高趋势，有些国家已超过10/10万，据此估计，我国甲型血友病人数在6万到10万人左右，病人由于凝血机制缺陷，偶遇内外伤往往流血不止，需要输注足量的第八因子制剂，由于第八因子在机体内的半衰期不长，(仅在8-12小时)故止血效果虽然显著，但不能持久，再次出血需再次输注；又因对该病至今尚无根治之术，故病人在一生中都需要第八因子的支持，所以这类病人的总数虽然不多，但需求量却很大。
[0003]我国本土生产的第八因子都来源于人血浆，该工艺具有操作复杂，容易污染，蛋白活性较低的缺点；此外由于原料血浆严重不足，第八因子供应持续紧张，从提高血友病患者的治疗率和保障急诊用药计，国内第八因子的缺口为现有产量的约20倍。
[0004]几年前Bayer公司的基因重组人第八因子(rhFVIII)在我国上市，理论上缓解了药品不足和用药安全的问题，但是进口 rhFVIII价格昂贵，多数患者难以负担。(血友病的第八因子治疗不在医保范围)。而目前我国并无公司有能力生产重组人凝血制品，无论是技术水平还是产量，都与国外公司存在巨大差距，并且无法弥补国内患者需求的缺口。并且类似rhFVIII这样的进口产品也为我国生物医药产业带来了生存压力。因此，开发具有自主知识产权的动物细胞培养生产重组人凝血八因子的工艺具有重要的社会和经济价值。
[0005]就重组人凝血八因子的产业化工艺而言，现代动物细胞生物反应器培养表达技术是上述产品的关键核心技术，该技术工艺复杂、难度大。这些先进的重组蛋白生产技术掌握在国外少数制药公司手中，帮助这些跨国公司攫取高额利润。而我国比世界先进技术水平相差悬殊，是牵扯到一系列技术的整体性工业的差距。因此，我们不仅需要快速追赶，缩小差距，更需要加快技术研发，在相关领域取得跨越式发展，形成真正具有自主知识产权的重组凝血八因子生产的核心关键技术。
[0006]就重组凝血八因子的产业化工艺而言，现代动物细胞生物反应器培养表达技术是上述产品的关键核心技术，该技术工艺复杂、难度大。目前，重组凝血八因子的生产表达方法通常为采用批培养，分批补料培养等。这些重组蛋白生产工艺虽然已经被放大至1000L以上，但是工艺本身存在如下缺点:
[0007]I)培养，表达过程的参数控制较少，不能完全或只能部分程度的控制培养环境的理化条件如温度，pH, C02和02浓度，营养物质浓度等；
[0008]2)即使通过反应器对理生化条件进行精确控制，但这种控制方法仍然缺乏对细胞状态本身的精确调节和控制。处于生长和蛋白过程中的细胞状态可以极大地影响最终表达的重组蛋白质量(如蛋白质的糖基化水平，蛋白二级、三级结构的正确形成)，而细胞状态并不仅仅是通过上述理生化等参数对细胞的影响所能决定的，对于重组凝血八因子这样的蛋白来说，生产获得的蛋白活性更加是远远比单纯的蛋白质量重要；
[0009]3)批次培养获得的细胞的重复性较低，且极大地受到不同实验和生产技术人员个人操作的影响，在试验和生产中会出现较大的批次间差异(batch to batch variat1n),这也是目前药物品质控制和监管领域的难题之一。因此，一种具有简便可靠性的鲁棒化(robust)可大规模化(scalable)应用于工业化(industrial)的重组凝血八因子的生产装置和工艺是目前表达工艺(process development)研究领域的瓶颈。
[0010]此外，对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。据公开报导，细胞生长的状态与整个群体的细胞周期分布具有一定的相关性。按照细胞在分裂过程中表现出的显著性差异的行为，细胞周期可以大致分为三个阶段，参见图1:
[0011]gaplphase (Glphase, Gl期)是一个细胞周期的起始阶段,在这个阶段,细胞内部进行相关蛋白质的合成等行为，细胞体积和基因组不产生任何变化；
[0012]随后，细胞会根据自身所处的环境来判断是否跨越过限制点(restrict1npoint),进入DNA合成期(DNA synthesis phase, S phase, S期),在S期,细胞主要进行自身基因组DNA的合成复制，复制完毕后，细胞成为2倍体，即基因组翻倍；
[0013]随后细胞进入有丝分裂期(gap2/mitotic phase, G2/M phase, G2/M期),在此时期，细胞完成有丝分裂，得到两个相同的子细胞，完成了一个细胞周期；
[0014]当细胞所处环境不佳，不利于细胞生长时，细胞无法跨过限制点，从而跳出细胞周期，进入一个额外的沉默期(resting phase, GOphase),成为不分裂细胞。
[0015]根据细胞在上述不同周期的细胞行为，通过细胞核染色试剂检测细胞核的DNA含量，配合流式细胞仪即可分辨单个细胞所处的细胞周期并绘制整个群体的细胞周期分布图。
[0016]对于正常培养过程中的细胞而言，细胞整体是一个异步培养体系(asynchronousculture)，即在培养过程中细胞整体并不处于细胞周期的相同位置，而是随机分布在细胞周期的各个位置。由于处于细胞周期不同时期的细胞在蛋白过程中表现出的特性可能并不相同，因此细胞整体所呈现的结果可能实质上是由处于不同细胞周期、不同状态的细胞的所占比例的动态变化一即细胞周期分布导致的。
【发明内容】
[0017]由于细胞生长状态本身极大地影响最终表达的重组蛋白质量，而传统的细胞培养和蛋白表达方法如批培养和补料培养工艺中对于细胞状态的控制相对缺乏，同时细胞状态并不仅仅是通过上述理化参数对细胞的影响所能决定的。因此，实现对细胞生长状态(即细胞生长，细胞周期分布等具体参数)的精确控制，是建立具有简便可靠性的鲁棒化(robust)可大规模化(scalable)应用于工业化(industrial)重组凝血八因子表达工艺(processdevelopment)的重要工作。
[0018]本发明的目的在于，针对目前重组凝血八因子传统制备工艺中的上述缺点，提供一种既可在线、连续、监控细胞培养环境中多种理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态(包括细胞周期等)的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产重组凝血八因子的方法，使其降低染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产重组凝血八因子的目的。
[0019]对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。本发明使用细胞比生长速率(μ )作为精确描述细胞生长的动力学参数，可以在一定程度上反映细胞状态。据发明人的研究结果，这一生长动力学参数与细胞周期分布、细胞在细胞周期内停留时间呈密切关系，通过特定装置组成联动系统调节，可以实现精确调控细胞状态的目标。
[0020]本发明的上述发明目的是通过以下技术方案实现的:
[0021]一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置，用以趋向性调节和控制细胞状态，该装置至少包括:培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐、若干理生化指标检测器、在线监控系统、细胞状态调节控制装置及联动系统、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和若干可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连接所述在线监控系统，所述在线监控系统与所述流体无菌控速推动器连接并发送控速指令给所述流体无菌控速推动器，上述所有容器类装置均通过可控速管道体系进行连接，其中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统用于所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。
[0022]优选地，所述细胞截留装置包