一种硬孔菌及其促进沉香属植物产生沉香的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及微生物应用领域，具体涉及一种硬孔菌（Rigidoporus vinctus)及其促进沉香属植物产生沉香的应用。
【背景技术】
[0002] 沉香为瑞香科（Thymelaeaceae)沉香属（Aquilaria)植物含有树脂的木材，沉香 的形成非常特殊，健康的白木香不能产生沉香类物质，只有受到物理伤害、化学伤害及真菌 侵染等外界的伤害后才诱导结香。质量高的沉香需要几年甚至几十年方能形成。由于天然 沉香形成的特殊性及结香周期长，所以结香技术成为研宄的热点。
[0003] 本课题通过对白木香微生物的研宄发现真菌对沉香的形成发挥着重要的作用，但 现有报道的真菌菌株及真菌促香方法的结香距离短、穿透能力有限，使之不能广泛应用，所 以找到能提高沉香品质的菌株应用于生产有着重要的意义。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明提供了一种能促进沉香的形成且形成的沉香扩散面大的菌 株及其应用，该菌株粉剂或膏剂、菌株发酵液、除菌后的滤液、及菌液/滤液浓缩制剂可促 进沉香属植物结香。
[0005]本发明第一方面提供了一种硬孔菌属真菌在促进沉香属（Aquilaria)、拟沉香 属（Gyrinops)或其他诱导型植物产生沉香中的应用，所述硬孔菌属于真菌界（Fungi)，担 子菌门（Basidiomycota)，伞菌钢（Agaricomycetes)，硬孔菌目（Polyporales)，薄孔菌科 (meripilaceae)，硬孔菌属（Rigidoporus) 〇
[0006] 本发明提供的硬孔菌属真菌的优点是：结香菌株接菌2个月后即可形成比较厚 的沉香层并且穿透面大。
[0007] 优选地，所述硬孔菌属真菌为硬孔菌（R.vinctus)。
[0008] 进一步优选地，所述硬孔菌（R. vinctus)为如第二方面所述的硬孔菌 (R. vinctus) 〇
[0009] 如本发明所述的，所述的"硬孔菌（R.vinctus)"和"硬孔菌（Rigidoporus vinctus) "之间可以互换。
[0010] 如本发明所述的，所述的"硬孔菌（Rigidoporus vinctus) ASAF02"和硬孔菌 (R. vinctus ASAF02)"之间可以互换。
[0011] 本发明第二方面提供了一种硬孔菌（Rigidoporus vinctus)，其在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC NO. 9594。
[0012] 本发明首次发现的该株硬孔菌（Rigidoporus vinctus)能促进沉香的形成且形 成的沉香扩散面大，对沉香的产业化有着重要的意义，将其命名为硬孔菌（Rigidoporus vinctus)ASAF02。
[0013] 本发明的硬孔菌（R. vinctus)ASAF02从白木香的结香层中分离获得，已于2014 年9月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址 为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保藏号为：CGMCC NO. 9594。
[0014] 硬孔菌（R. vinctus)ASAF02在PDA培养基上的形态特征为：在PDA的培养基上，菌 落白色，匀质状，边缘整齐；菌丝纤细，有叉状分枝，不易产孢。硬孔菌（R. Vinctus)ASAF02， 其rDNA的ITS长度为620bp，序列为序列表中序列3所示的核苷酸序列。
[0015] 本发明第三方面还提供了硬孔菌（Rigidoporus vinctus)在促进沉香属 (Aquilaria)植物产生沉香中的应用。
[0016] 优选地，所述硬孔菌（R.vinctus)为如第二方面所述的硬孔菌（R.vinctus)。
[0017] 本发明第四方面提供了一种硬孔菌（R.vinctus)菌株、菌丝（优选为菌丝粉剂或 菌丝膏剂）、菌株发酵液、发酵液除菌获得的滤液、菌株发酵液/菌株发酵液滤液浓缩制剂 中的至少一种作为促进沉香属（Aquilaria)、拟沉香属（Gyrinops)或其他诱导型植物结 香的结香剂中的应用。
[0018] 优选地，所述硬孔菌（R.vinctus)为如第二方面所述的硬孔菌（R.vinctus)。
[0019] 本发明第五方面提供了一种结香剂，其活性成分包括硬孔菌（R.vinctus)菌株、 菌丝（优选为菌丝粉剂或菌丝膏剂）、菌株发酵液、发酵液除菌获得的滤液、菌株发酵液/菌 株发酵液滤液浓缩制剂中的至少一种。
[0020] 优选地，所述硬孔菌（R.vinctus)为如第二方面所述的硬孔菌（R.vinctus)。
[0021] 如本发明所述的，"除菌后滤液中的活性成分"包括但不限于为由如下方法制备： 采用本领域常规的分离提纯方法，提取到的可作为促香剂的成分，所述的促香剂为促进沉 香属（Aquilaria)、拟沉香属（Gyrinops)或其他诱导型植物结香的结香剂。
[0022] 如本发明所述的，"菌株发酵液"的获得方法优选为将硬孔菌（R. vinctus)(优选为 ASAF02)菌株接种于温度为15-35°C的液体培养基中培养，得到菌株发酵液。所述液体培 养基的pH值可以为pH3-ll;具体的培养基可以为液体PDA培养基，培养的时间可以为3-7 天，培养的方式可以为摇床培养。培养的温度具体可以为30°C。
[0023] 如本发明所述的，所述"菌株发酵液/菌株发酵液滤液浓缩制剂"表示"菌株发酵 液浓缩制剂或菌株发酵液除菌后的滤液浓缩制剂"。
[0024] 如本发明所述的，所述菌丝可制备成菌丝粉剂或膏剂。
[0025] 本发明第六方面提供了一种促进沉香属（Aquilaria)、拟沉香属（Gyrinops) 或其他诱导型植物产生沉香的方法，是将本发明第五方面所述的结香剂接种于沉香属 (Aquilaria)植物根、莖和/或分枝上。
[0026] 本发明利用硬孔菌（R.vinctus)菌株、菌丝（优选为菌丝粉剂或菌丝膏剂）、菌 株发酵液、除菌的滤液、菌株发酵液/菌株发酵液滤液浓缩制剂促进结香，具体的技术方案 为：将硬孔菌（R.vinctus)菌株、菌丝（优选为菌丝粉剂或菌丝膏剂）、菌株发酵液、除菌的 滤液、菌株发酵液/滤液浓缩制剂作为结香剂中的至少一种接种到白木香根、茎或分枝上。
[0027] 优选地，上述的接种方式为刮皮接种、通体结香技术接种或钻洞接种方式。
[0028] 所述通体结香技术接种优选为：将接种硬孔菌（Rigidoporus vinctus)发酵菌 液、发酵液去除菌体后的滤液、菌株发酵液浓缩制剂、菌株发酵液滤液浓缩制剂中的至少一 种直接用通体结香法输入沉香属的树上通过输液装置注入沉香属（Aquilaria)植物，利 用植物的蒸腾作用疏导至植物茎干、枝条、根等各器官，促使整个植株内部结香；所述钻洞 接种为在待接种的沉香属（Aquilaria)植物自根部到地上50cm-lm处部位钻洞，洞深至 3_5cm，将上述接种硬孔菌（Rigidoporus vinctus)菌株、菌丝（优选为菌丝粉剂或菌丝膏 剂）、菌株发酵液、除菌的滤液、滤液中的活性成分、菌株发酵液/菌株发酵液滤液浓缩制剂 中的至少一种注入洞中。进一步优选地，所述通体结香技术接种方式中，所得的菌液和无菌 滤液直接用通体结香法输入沉香属的树上。
[0029] 优选地，所述硬孔菌（R. vinctus)为如第二方面所述的硬孔菌（R. vinctus)。
[0030] 如本发明所述的，在所述的第一、三、四、五、六方面中，所述沉香属（Aquilaria) 植物包括但不限于马来沉香（Aquilaria malaccensis),越南沉香（Aquilaria crassna) 或白木香（Aquilaria sinensis);优选为白木香（Aquilaria sinensis)。所述白木香的树 龄优选为6年以上的白木香。
[0031] 本发明提供的硬孔菌的优点是：结香菌株硬孔菌（R. vinctus)(优选为ASAF02)接 种2个月后即可形成比较厚的沉香层并且穿透面大。该菌株在PH2-11和温度15-35°C的条 件下仍能生长，说明具有很强的环境耐受力。本发明首次发现硬孔菌（R. vinctus)(优选为 ASAF02)能促进白木香结香且形成且穿透面大，对沉香的产业化有着重要的意义。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明的硬孔菌（R. vinctus)ASAF02菌株促进沉香形成及真菌形态学特征 观察；其中A为硬孔菌（R. vinctus) ASAF02促进结香效果图（A1打孔处A2距离孔口 50cm 处）；B 为硬孔菌（Rigidoporus vinctus) ASAF02 的菌落。
[0033] 图2为本发明实施例3的硬孔菌（R. vinctus) ASAF02菌株促进结香所产沉香的薄 层鉴定；BK为健康的白木香，ST为色酮对照，CK为中国药典规定的对照药材，IW为ASAF02 菌株接种2个月的沉香。
[0034] 图3为本发明实施例4的硬孔菌（R. vinctus) ASAF02菌株促进结香所产沉香的薄 层鉴定；BK为健康的白木香，ST为色酮对照，CK为中国药典规定的对照药材，BW为ASAF02 菌株接种3个月的沉香。
[0035] 图4为本发明实施例5的硬孔菌（R. vinctus) ASAF02菌株促进结香所产沉香的薄 层鉴定；BK为健康的白木香，ST为色酮对照，CK为中国药典规定的对照药材，IW为ASAF02 菌株接种70天的沉香。
【具体实施方式】
[0036] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0037] 本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。
[0038] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0040] 下述实施例中所用的PDA液体培养基：称量去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮 30min，纱布过滤，加葡萄糖20g，最后定容至1L。固体PDA培养基为：称量去皮马铃薯200g， 切成小块，加水煮30min，纱布过滤，加葡萄糖20g，加15-20g琼脂，最后定容至1L。
[0041] 实施例1硬孔菌（R. vinctus)ASAF02菌株的分离、筛选和鉴定
[0042] 本发明利用组织分离法进行菌株分离。具体方法如下所述：在海南省万宁市铜铁 岭采取天然的沉香样品，在水龙头下冲洗30min，然后用70%的酒精消毒3-5min，用无菌水 冲洗3次，然后用10% (质量百分浓度）的次氯酸钠浸泡5min，再用无