具有改善的药代动力学性质的治疗性多肽融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明一般地涉及具有治疗效能的融合蛋白。具体而言，本发明涉及通过将治疗 性多肽与一个或多个柔性非结构性多肽序列及三聚体支架蛋白融合，改善所述治疗性多肽 半衰期的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 许多治疗性多肽注射入受试者时存在体内终末半衰期短和热稳定性差等缺陷。血 浆半衰期短普遍是由于肾清除率快以及体循环期间发生的酶降解所致。为达到其最佳效 力，治疗性多肽常常需要较长的半衰期时间。增加治疗性多肽的体内停留时间可降低其给 药频率，使其更便于病人使用。
[0003] PEG化（PEGylation)已广泛用于延长治疗性多肽的半衰期（见综述文献[1-4]、 专利1-9)。PEG化改变了生物医学分子的理化性质，例如其构象、静电结合和疏水性，从而 带来该药物在药代动力学行为上的改进。一般而言，PEG化改善药物溶解度，降低免疫原 性。PEG化也增加药物稳定性和缀合物在血液中的保留时间。然而，PEG化对于蛋白质的生 物活性有着严重的后果。PEG化蛋白的活性一般会降低至20-50分之一 [2、5](专利1-9)。 此外，PEG化位点需要小心确定，以避免干扰治疗性多肽的活性位点。对于一些短肽，例如 GLP-1、PTH和降钙素，很难选择合适的PEG化位点而不妨碍该肽的生物活性。再者，PEG是 相关聚合物的非均匀混合物，其缀合至治疗性多肽会产生具有类似的分子大小和化学性质 的许多不同化学物种（species)。这会令纯化变得复杂，并增加PEG化产物的生产成本。
[0004] 据报道，将治疗性多肽与人IgG Fc片段或人血清白蛋白（HSA)融合可显著增加该 治疗性多肽的半衰期[6-9](专利10、11、12)。然而，具有IgG的Fc片段或HSA的重组融合 蛋白需要从真核系统例如哺乳动物细胞系或酵母细胞中合成，其显著增加了该重组蛋白的 成本。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及提高所述治疗性多肽的药物特性、稳定性、溶解度和安全性。本发明特 别有益于改善治疗性多肽的药代动力学性质，例如体内终末半衰期。
[0006] 本发明一方面提供了融合蛋白，其包含融合至支架蛋白的治疗性多肽，所述支架 蛋白在溶液中形成同源三聚体。所述融合蛋白还包含一个或多个柔性非结构性多肽序列。 在一些实施方式中，所述融合蛋白还包含人源的蛋白连接部分（proteinous connecting moiety, PCM)。在【具体实施方式】中，所述蛋白连接部分为具有细长形状（elongaged shape) 的蛋白质序列，例如人纤连蛋白III型结构域。
[0007] 所述柔性非结构性多肽序列含有1至3000个氨基酸残基，其中G、S、E、A、P和T 合计构成所述柔性非结构性多肽序列的超过90% ;且据G0R算法测定，所述柔性非结构性 多肽序列具有大于90%的非结构性无规卷曲形成[10]。将治疗性多肽与一个或多个柔性 非结构性多肽序列及三聚体支架蛋白（trimeric scaffold protein)融合能显著增加该融 合蛋白的表观分子量，并提高所述治疗性多肽的体内半衰期。此外，该方法使所述治疗性 多肽呈三价，这可大大提高所述治疗性多肽的效力（potency)和疗效（efficacy)(见综述
[11])。由本发明提供的这一新颖方法称为"三叉戟技术"（Trident technology)，能够有 效地增加所述多肽分子的流体力学半径和/或回转半径（Radius of gyration, Rg)，以延长 其体内半衰期。所述融合蛋白内的柔性非结构性多肽序列和蛋白连接部分（PCM)对提高所 述融合蛋白的表观分子量具有显著帮助。
[0008] 在本发明中，所述治疗性多肽可以以多种方式与一个或多个柔性非结构性多肽及 三聚体支架蛋白融合。在一些实施方式中，本发明的融合蛋白从N端至C端可以按下述公 式构造：
[0009] (接头）m _ TP _ (接头）n -支架_ (接头）k或
[0010](接头）m-支架-(接头）n-TP-(接头）k
[0011] 其中：
[0012] (a)接头为上述柔性非结构性多肽接头；
[0013] (b)TP为治疗性多肽；
[0014] (c)支架表示所述支架蛋白，其在溶液中形成同源三聚体；
[0015] (d)m为0或1 ;n为0或l，k为0或1，且m+n+k> = 1。这些数字表示所标明的多 肽的存在数量。
[0016] 在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白还可以含有人源的蛋白连接部分。所 述治疗性多肽通过人源的蛋白连接部分与所述柔性非结构多肽序列连接。所述融合蛋白对 受试者给药时，相较所述治疗性多肽单独给药表现出改善的药代动力学性质。所述融合蛋 白从N端至C端可以按以下公式构造：
[0017] (接头）m - TP -环-PCM -(接头）」-支架-(接头）k或
[0018] (接头）m-支架_ (接头）n_PCM -环-TP-(接头）k
[0019] 其中：
[0020] (a)接头为上文表征的所述柔性非结构性多肽接头；
[0021] (b)TP为所述治疗性多肽；
[0022] (c)支架表示所述支架蛋白，其在溶液中形成同源三聚体；
[0023] (d)m是0或l;n为0或l，j为0或l，k为0或1，且m+n+j+k> = 1。这些数字表 示所标明的多肽的存在数量。
[0024] (e)PCM为人源的所述蛋白连接部分；以及
[0025] (f)环为柔性环，指具有0至100个残基的长度可变的蛋白质序列。这些柔性环富 含甘氨酸（G)和丝氨酸（S)。这些柔性环也可含谷氨酸（E)、丙氨酸（A)、脯氨酸（P)和苏氨 酸（T)。据G0R算法测定，这些柔性环具有多于95%的非结构性无规卷曲形成。
[0026] 在本发明的优选实施方式中，所述柔性非结构性接头表现为一个或多个柔性非结 构性pCloud多肽。所述pCloud序列的特征在于：(a)所述pCloud总氨基酸残基为至少 100至约3000个氨基酸残基；(b)所述pCloud多肽系通过使用源自人纤维蛋白原a链的 部分或全部片段生成（表1)。在pCloud序列中，所述纤维蛋白原片段两侧为长度多样的柔 性环。因此所述pCloud多肽主要是人源的，并具有低免疫原性。（c)所述pCloud多肽富 含甘氨酸（G)、丝氨酸（S)和谷氨酸（E)。该pCloud多肽还含有丙氨酸（A)、脯氨酸（P)、精 氨酸（R)和苏氨酸（T)。G、S、E、A、P和T合计构成所述pCloud序列的超过90 %。（d)据 G0R算法测定，所述pCloud序列具有超过90%的非结构性无规卷曲形成[10];以及（e)据 TEPIT0PE算法预测，所述pCloud序列不含任何T细胞表位[12]。
[0027]在一些实施方式中，所述pCloud多肽代表源于人纤维蛋白原a链的柔性非结构 性多肽。源自人纤维蛋白原a链的片段（如表1所示）可被用作构成pCloud多肽的构件。 在pCloud序列中，所述人纤维蛋白原a链片段两侧为具有0至100个残基的长度可变的 柔性环。将一个或多个pCloud多肽附着在治疗性多肽上可显著增加该治疗性多肽的表观 分子量，并改善该治疗性多肽的体内半衰期。与pCloud序列连接的治疗性多肽的体内半衰 期可以通过改变pCloud序列的长度进行调整。更重要的是，该pCloud序列基于人纤维蛋 白原a链生成，因此，该pCloud多肽在给药时可能不会刺激人患者的免疫应答。
[0028] 在一些实施方式中，本发明的支架蛋白选自由以下构成的组：人胶原蛋白非胶 原（noncollagenous，NC)结构域，其在溶液中形成稳定的同源三聚体；具有Clq样分子 结构的蛋白质，其在溶液中形成同源三聚体；具有TNF样分子结构的蛋白质，其在溶液中 形成同源三聚体；以及具有C型凝集素样结构域（C-type lectin-like domains, CTLD) 的蛋白质，其在溶液中形成同源三聚体。在一些实施方式中，所述支架蛋白选自由以下 构成的组:Multiplexin型人胶原蛋白内的NC1结构域、FACIT型胶原蛋白内的NC2结构 域、人 Clq A 链、Clq B 链，Clq C 链、cbln 家族成员、人 EMILIN-1、多聚素（multimerin)、 ACRP30/脂联素、adipolin、抵抗素、抵抗素样分子（resistin-like molecule，RELM)激 素家族成员、人 TNFalpha、TNFbeta、TRAIL、RANK 配体、Fas 配体、CD 30 配体、CD40 配体、 CD27配体、0X40L、CD137、甘露聚糖结合凝集素（MBL)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋 白D(SP-D)、肝胶原凝集素1 (collectin liver 1，CL-L1)、胎盘胶原凝集素1 (CL-P1)、共凝 集素（conglutinin)、43kDa 胶原凝集素（CL-43)和 46kDa 胶原凝集素（CL_46)、Langerin、 四连蛋白（Tetranectin)及其功能性变体。在优选的实施方式中，Multiplexin型人胶原 蛋白（如胶原蛋白XV和XVIII)内的NC1结构域被选作本发明中的支架蛋白。
[0029] 在一些实施方式中，所述治疗性多肽选自由以下构成的组：人胰高血糖素样 肽-1 (GLP-1)、艾塞那肽（Exenatide)、GLP-2、C肽、降钙素、人甲状旁腺激素（PTH)、胰高血 糖素、