一种无血清的脂肪干细胞培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞技术领域，涉及一种无血清的脂肪干细胞培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研宄发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有来源广泛，体内储备量大，取材容易，少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点。
[0003]传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素。血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点:批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，使用不方便，成分不明确，有抑制细胞生长的成分，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件。
[0004]目前已有一些市售干细胞无血清培养基，比如Life Technology公司的间充质干细胞无血清培养基StemPro MSC SFM无血清培养基。但是，现有市售无血清培养基存在细胞贴壁差，操作不便等缺陷，比如Gibco无血清培养基的应用需要进行培养瓶包被。此外，现有市售无血清培养基还存在细胞增殖不够理想等缺陷。中国专利CN103255103公开了一种无血清的脂肪干细胞培养基，该培养基以DMEM-LG为基础培养基，虽然添加了肝素、谷氨酰胺和白血病抑制因子等组分，但未添加胰岛素、白蛋白等营养成分，脂肪干细胞的生长增殖效果不够理想。中国专利CN102732477公开了一种无血清的脂肪干细胞培养基，以高糖型DMEM为基础培养基，葡萄糖的浓度高达4500mg/L，添加牛磺酸、还原型谷胱甘肽和铜蓝蛋白等组分，但没有促进贴壁的细胞因子，存在细胞贴壁性差、增殖缓慢的缺陷。
[0005]因此，现有技术存在细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想等问题。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想的问题，发明人通过大量试验筛选，得到一种新脂肪干细胞无血清培养基，该培养基无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高。
[0007]本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
[0008]本发明提供一种无血清的脂肪干细胞培养基，包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素0.5~5mg/mL、重组转铁蛋白1~5 μ g/mL、维生素C 5-50 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~5mg/mL、成纤维细胞生长因子5~50ng/mL、血小板衍生生长因子5~50ng/mL、表皮生长因子5~50ng/mL、胰岛素样生长因子5~50ng/mL、转化生长因子5~50ng/mL、纤维连接蛋白5~50ng/mL、胎球蛋白0.5~5mg/mL、茶多酸5~50yg/mL和干细胞生长因子5~30ng/mL。
[0009]采用上述技术方案的无血清的脂肪干细胞培养基，无需添加动物血清，可以实现脂肪干细胞的快速增殖，维持良好的干细胞幼稚状态，具有良好的细胞诱导分化潜能。
[0010]本发明提供的无血清的脂肪干细胞培养基中，通过纤维连结蛋白(fibronectin)和胎球蛋白(Fetuin)的协同作用，大大增强了脂肪干细胞的贴壁性能；茶多酚有助于维持脂肪干细胞的幼稚状态和细胞干性，防止脂肪干细胞的老化；干细胞生长因子(SCF)则可促进脂肪干细胞的生长增殖。
[0011]优选地，本发明提供的无血清的脂肪干细胞培养基，包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素0.5~2mg/mL、重组转铁蛋白1~4 yg/mL、维生素C5~30 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~2mg/mL、成纤维细胞生长因子5~20ng/mL、血小板衍生生长因子5~20ng/mL、表皮生长因子5~20ng/mL、胰岛素样生长因子5~20ng/mL、转化生长因子5~20ng/mL、纤维连接蛋白5~20ng/mL、胎球蛋白0.5~3mg/mL、茶多酸5~20yg/mL和干细胞生长因子5~15ng/mL。
[0012]更优选地，本发明提供的无血清的脂肪干细胞培养基，包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素lmg/mL、重组转铁蛋白2.5yg/mL、维生素C16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、成纤维细胞生长因子10ng/mL、血小板衍生生长因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、胰岛素样生长因子10ng/mL、转化生长因子10ng/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、茶多酸10 μ g/mL和干细胞生长因子10ng/mL。
[0013]优选地，所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，所述血小板衍生生长因子为roGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)，所述转化生长因子为转化生长因子-β (TGF-β)。
[0014]优选地，本发明提供的无血清的脂肪干细胞培养基，还包括1%体积百分比的非必需氨基酸，例如，购自广州赛业生物科技有限公司的非必须氨基酸，货号ΝΕΑΑ-10201-100。本领域技术人员还可在本发明的基础上，根据实际需要添加其他不会导致负面效果的成分。
[0015]相应地，本发明还提供无血清的脂肪干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤:向MDM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素母液、重组转铁蛋白母液、维生素C母液、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子母液、血小板衍生生长因子母液、表皮生长因子母液、胰岛素样生长因子母液、转化生长因子母液、纤维连接蛋白母液、胎球蛋白母液、茶多酚母液和干细胞生长因子母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
[0016]优选地，所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，所述血小板衍生生长因子为roGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)，所述转化生长因子为转化生长因子-β (TGF-β)。
[0017]相应地，本发明还提供无血清的脂肪干细胞培养基在脂肪干细胞培养中的用途。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供了一种新的无血清的脂肪干细胞培养基，与传统的含血清培养基和其他无血清培养基相比，本发明提供的培养基培养的脂肪干细胞能够保持较好的干细胞幼稚形态，具有更好的细胞增殖速率、细胞干性和细胞诱导分化潜能。本发明提供的制备方法简单，制得的无血清的脂肪干细胞培养基用于脂肪干细胞的培养，表现出优异的细胞性能。
【附图说明】
[0019]图1含不同浓度干细胞生长因子的培养基对细胞增殖的影响。
[0020]图2 P5代脂肪干细胞在3种培养基中培养的形态。
[0021]图3脂肪干细胞在3种培养基中的增殖曲线。
[0022]图4 P3代脂肪干细胞在3种培养基中的细胞克隆数量。
[0023]图5培养基I培养的P5代脂肪干细胞的表面抗原表达水平。
[0024]图6培养基2培养的P5代脂肪干细胞的表面抗原表达水平。
[0025]图7培养基3培养的P5代脂肪干细胞的表面抗原表达水平。
[0026]图8 3种培养基培养的P5代脂肪干细胞的成脂诱导分化染色结果图。
[0027]图9 3种培养基培养的P5代脂肪干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
[0028]图10 3种培养基培养的P5代脂肪干细胞的成骨诱导分化染色结果图。
[0029]图11 3种培养基培养的P5代脂肪干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化相关基因OPN的表达结果图。
【具体实施方式】
[0030]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0031]本发明中的各组分均为常规市售产品，例如干细胞生长因子购自Sigma，货号S7901。本发明中，培养基1:本发明实施例二提供的无血清的脂肪干细胞培养基；培养基2 -Life Tecnology公司的的StemPro MSC SFM无血清培养基，货号A10332-01 ;培养基3:IMDM基础培养基+10%体积百分比的FBS。
[0032]实施例一含不同浓度干细胞生长因子的培养基对细胞增殖的影响
发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的无血清的脂肪干细胞培养基配方，并进一步对干细胞生长因子的浓度影响进行了考察。将Pl代ADSCs以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，分别用含不同浓度干细胞生长因子的无血清的脂肪干细胞培养基(与培养基I相比，区别仅在于干细胞生长因子的浓度不同)培养，每3天将细胞用0.25%胰酶消化，收集细胞并计算数量，并以5000个/cm2的密度再次接种培养，直至P5代，根据每个代次的细胞收获数量，绘制细胞增殖曲线，结果如图1所示。
[0033]从图1可知，干细胞生长因子的浓度为10ng/mL时，细胞增殖速率最高，浓度为5ng/mL和20ng/mL时也具有较高的细胞增殖速率，但浓度达到30ng/mL时，不仅未提高细胞增殖速率，反而降低了细胞增殖速率。因此，干细胞生长因子的浓度对本发明提供的无血清的脂肪干细胞培养基具有至关重要的影响。
[0034]实施例二无血清的脂肪干细胞培养基
无血清的脂肪干细胞培养基，包括MDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度:重组人胰岛素lmg/mL、重组转铁蛋白2.5 μ g/mL、维生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、bFGF 10ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β 10ng/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、茶多酸10 μ g/mL和干细胞生长因子10ng/mL。
[0035]制备方法:向MDM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素母液、重组转铁蛋白母液、维生素C母液、人血清白蛋白、bFGF母液、PDGF-bb母液、EGF母液、IGF-1母液、TGF-