强冬性白菜型冬油菜丙二醛mda分子标记及qtl定位的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种强冬性白菜型冬油菜 丙二醛MDA基因 QTL位点，同时还涉及与强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDA基因 QTL位点连 锁的分子标记。
【背景技术】
[0002] 白菜型油菜在我国栽培历史悠久，种质资源丰富，是我国重要的油料作物之一。但 白菜型油菜以春性为主，冬性白菜型冬油菜种质缺乏，尤其适宜北方旱寒区种植的强冬性 冬油菜品种缺乏。我国北方气候严寒，冬油菜具备优异的抗寒性才能安全越冬，因此抗寒品 种选育是北方冬油菜发展的关键。采用常规育种方法选育抗寒材料费时费力，且选择效率 较低，如果借助分子标记辅助育种，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高 选择效率。
[0003] 丙二醛MDA是植物膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤因此 在植物抗寒生理研宄中丙二醛MDA含量是一个常用指标。关于丙二醛MDA在植物体内变化 的研宄甚多，但对其分子标记及QTL定位的研宄尚未见报道。本研宄通过QTL定位，旨在筛 选出强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDA的QTL位点和分子标记，用于强冬性白菜型冬油菜丙 二醛MDA基因的克隆和冬油菜抗寒育种的分子标记辅助选择。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供了 2个强冬性白菜 型冬油菜丙二醛MDA的QTL位点，该2个位点的效应值都比较高，对强冬性白菜型冬油菜丙 二醛MDA含量调控起着重要作用，可用作定位克隆和分子标记辅助选择。
[0005] 本发明还提供4个与强冬性白菜型冬油菜油丙二醛MDA的QTL位点连锁的分子标 记，这些标记与QTL位点的遗传距离较近且是基于PCR技术的SSR和InDel标记，因而可 靠且使用方便，将对强冬性白菜型冬油菜抗寒育种提供便利。
[0006] 为解决本发明的技术问题采用如下技术方案： 强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDA分子标记及QTL位点，其筛选包括有以下步骤： (1)构建分离群体：利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'陇油7号'和强 抗寒冬油菜'陇油9号'配置杂交组合，杂交Fl代自交产生F2代分离群体。本发明用到 的实验材料由甘肃农业大学油菜遗传育种课题组提供。
[0007] (2)油菜叶片DNA提取：采用CTAB法提取亲本'陇油7号'和'陇油9号'及F2 代分离群体的叶片DNA。
[0008] (3)引物来源及合成：由上海生物工程技术有限公司合成315对引物，引物来源 于WWW. UK crop, net发表的油菜微卫星引物序列以及Brassica Database网站http:// brassicadb. org/上公布的10个染色体上的所有引物，其中SSR引物51对，InDel引物264 对。
[0009] (4)多态性引物筛选：利用合成的引物对两亲本DNA进行PCR扩增，筛选出具有多 态性的引物，该过程涉及PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、照相等步骤。
[0010] (5)多态性引物在F2代检测：将筛选出的多态性引物在F2代中进行检测，获得基 因型数据，该过程与（4 )步骤基本相同。
[0011] (6)遗传连锁图构建及QTL定位：根据F2代基因型数据，利用QTL IciMapping V3. 3软件进行遗传连锁图构建及QTL定位。
[0012] 获得强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDA 2个QTL位点，分别命名为：Qmda. gsau-lA和 Qsmda. gsau-8A，与2个强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDA的QTL位点连锁的4个分子标记， 分别是出1'10101211、0112?11〇?1)、81'1010839和1^2412,4个分子标记的序列分别如下 ： BrID101211-F ： TCTCTCCCACAGAAGAAAAA BrID101211-R ： GGAGTTTGAGACTTCGATGA OI12F11(Rl)-F ：AAGGACTCATCGTGCAATCC OI12F11 (Rl)-R ：GTGTCAGTGGCTACAGAGAC BrID10839-F ：AGGAACAATACCCATTTGTG BrID10839-R ：GGTGTTTGTGTGTTCGGTA Ra2-E12-F ：TGTCAGTGTGTCCACTTCGC Ra2-E12-R ：AAGAGAAACCCAATAAAGTAGAACC 〇
[0013] Qmda. gsau-ΙΑ位点位于IA染色体上，与分子标记fcID101211和0I12F11(R1)连 锁，可解释28. 9663%的表型变异，加性效应为0. 8136,显性效应15. 8908。
[0014] Qsmda. gsau_8A位于8A染色体上，与分子标记BrID10839和Ra2_E12连锁，可解释 11. 1783%的表型变异，加性效应为-2. 1194,显性效应-3. 1315。
[0015] 本发明的有益效果：本发明首次定位得到2个强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDAQTL 位点，且给出了 4个与强冬性白菜型冬油菜油丙二醛MDA的QTL位点连锁的分子标记，分别 解释28. 9663%和11. 1783%的表型变异。在常规抗寒育种中，试验材料需通过越冬来判断 其抗寒性的强弱，费时费力。通过检测强冬性白菜型冬油菜丙二醛MDA的QTL位点，在苗期 就可以筛选材料，大大提高了筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。同时强冬性白菜型 冬油菜丙二醛MDA的QTL位点的获得，可进一步克隆控制合成强冬性白菜型冬油菜丙二醛 MDA的基因，为强冬性白菜型冬油菜抗寒机理的探索提供技术支撑。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明强冬性超强抗寒冬油菜'陇油7号'和强抗寒冬油菜'陇油9号'杂 交F2代群体丙二醛MDA含量分布图； 图2为本发明利用两亲本筛选多态性引物； 图3为本发明多态性引物0113C12a在F2代中的检测结果； 图4为本发明Qmda. gsau-lA位点在2A染色体的位置及LOD曲线示意图； 图5为本发明Qmda. gsau-8A位点在8A染色体的位置及LOD曲线示意图。
【具体实施方式】
[0017] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0018] 实施例1 :强冬性白菜型冬油菜分离群体的构建及丙二醛MDA含量测定。
[0019] 本实施例中使用的分离群体具体构建如下： (1)2010年8月利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'陇油7号'和强抗 寒冬油菜'陇油9号'配置杂交组合，2011年5月收获Fl代种子。
[0020] (2)2011年8月播种Fl种子，2012年4月套袋自交，获得F2代种子。
[0021] 2012年8月播种F2代种子。待苗期随机选取103株挂牌标记，于11月初采集新 鲜幼叶，用冰盒带回实验室并保存于_70°C超低温冰箱。采用硫代巴比妥酸（TBA)显色法测 定丙二醛（MDA)含量。结果表明：F2代丙二醛（MDA)含量呈正态分布，且变异范围很宽，证 明丙二醛(MDA)性状属于数量性状（图1)。
[0022] 实施例2 :亲本和F2代分离群体叶片总DNA的提取。
[0023] 采用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下： (1)采摘健康幼叶作为提取油菜基因组DNA的材料，用蒸馏水洗净，用纸吸干。
[0024] (2)取新鲜的叶片0. 5g左右置于研钵中，加入液氮，迅速研磨至发白粉末状后立 即装入2ml离心管。
[0025] (3)加入已预热的2 X CTAB提取缓冲液700ul浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分 散开，于65°C水浴60min，其间轻柔混合2-3次。
[0026] (4)取出离心管，冷却至室温，加入700ul的氯仿/异戊醇（24/1)，轻缓颠倒混匀， 静置10 min。
[0027] (5) 13000rpm 离心 lOmin。
[0028] (6)取上清600ul转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1)，轻缓颠 倒混匀，室温放置IOmin。
[0029] (7) 13000rpm离心10min，取上清400ul转移至新离心管中，加等体积已预冷的异 丙醇，保存于_20°C，静置20 min。
[0030] (8)13000rpm离心10min，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清，用600ul 70%的乙 醇洗涤沉淀2次，室温下微干。加入300ul去离子水溶解沉淀。
[0031] (9)加入Iul RNase (10mg/ml)置于37°C水浴60 min，每个离心管加300ul去离 子水，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。
[0032] (10)吸取上清400ul转入新离心管，加入上清体积1/10的3mol/LNaAC溶液，2. 5 倍体积的预冷无水乙醇沉淀DNA，置于-20°C，20 min左右，12000rpm离心10min，弃上清。