一种产n-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及产N-乙酰神经氨酸的重组微生物及其构建方法与应用。早在1927年，美国的Landsteiner等人就发现特定的动物脂质制各物中含有类似糖的组分，它可以与Bial’s试剂反应呈紫色。之后，Klenk等人用温和的方法分别裂解脑糖脂和颁下腺粘蛋白，从中分离出与Bial’s试剂反应呈紫色的物质，将其命名为唾液酸(Sialic acid)。迄今为至，已发现唾液酸家族的成员有四十余种，其中最为重要的是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，它的含量占整个唾液酸家族的99%以上，人们对它的研宄也更为深入。一般所说唾液酸的商业化生产即为Neu5Ac的工业规模制备，主要包括:从天然材料提取、化学合成、酶法合成以及微生物发酵等方法。
[0002]唾液酸以糖复合物的形式广泛存在于动物细胞表面，但含量相当低。自从发现唾液酸以来，人们已分别从燕窝、牛奶、禽蛋等天然原料中提取得到唾液酸。Masskam Shimatanl 从酪蛋白中提取唾液酸(Masskma Shrinatnaletal.UnitedStates Patent, 5270462，Dee.14，1993) o Martin 等从燕窝中提取到了唾液酸(MartinJE, Tanenbaum Sff.Carbohydrate Research, 1976.423-425)。2003 年，Koketsu 对乌骨鸡鸡蛋中唾液酸的含量进行了研宄，在温和酸性条件下加热至70°C _90°C发现从单个鸡蛋中提取的唾液酸含量约为 218mg(Koketsu M.British Poultry Science, 2003，44:145-148)。但唾液酸在天然原料中含量极低，分离纯化过程比较复杂且收率低，因而难于满足工业化生产的需要。
[0003]化学法合成唾液酸反应条件苛刻，需要铟等贵重金属作为催化剂，反应步骤繁多。例如在酸性醇溶液中，α -溴甲基丙稀酸在铟的催化作用下对N-乙酰甘露糖胺进行丙烯基化反应，再对得到的产物进行臭氧化反应即可得到N-乙酰神经氨酸(Chan T H, Lee MC.Journal of Organic Chemistry, 1995，60:4228-4232)。但是，化学合成法涉及到复杂的基团保护和去保护步骤以及环境保护等问题，特别是产率偏低，故在应用过程受到限制。
[0004]N-乙酰神经氨酸的酶法合成主要以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)的催化下生成N-乙酰神经氨酸。为了克服N-乙酰甘露糖胺价格昂贵的问题，人们通过碱性条件或使用N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶(GlcNAc2-epimerase)使廉价的N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺。
[0005]近几年来，研宄人员将重组表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的两种大肠杆菌细胞作为生物催化介质，转化GlcNAc生产Neu5Ac (IsafomiMaru, Jua Ohnishi, Y.Journalof B1science and B1science,2002，93 (3):258-265)。这种方法不用分离纯化酶，同时由于细胞膜的保护，酶相对更稳定，辅助因子容易再生。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种重组微生物催化生产N-乙酰神经氨酸的方法，所述重组菌为是克隆E.coliK12基因组中N-乙酰神经氨酸醛缩酶nanA基因和来源于集胞藻(Synechocystis sp.)的N-乙酰葡萄糖胺_2_异构酶slr975基因并经过密码子优化后构建而成的重组E.coli。
[0007]所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803，核苷酸序列如GeneBank登陆序列号:NC_000911.1所示；所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因来源于E.coli K12，核苷酸序列如GeneBank登陆序列号:NC_000913.3所示；
[0008]将N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA和密码子优化后的N-乙酰葡萄糖胺_2_异构酶基因slr975分别连接到载体pET-28a(+)上。
[0009]本发明还提供了一种构建产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的方法，将slrl975基因片断和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将slrl975基因片断插入质粒pET-28a (+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET_28a (+) -sir ；将nanA基因片断和pET_28a (+)用限制性内切酶Nde I和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将nanA基因片断插入质粒pET_28a (+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒 pET-28a (+) -nanA ;将重组质粒 pET_28a (+) -sir 和 pET_28a (+) -nanA 分别转化转化E.coli,分别得到重组微生物 E.coli/pET_28a(+) -sir 和 Ε.coli/pET_28a(+) -nanA。
[0010]所述重组菌诱导表达条件:N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因利用IPTG分别进行诱导表达，其特征在于诱导培养基为LB培养基，诱导表达温度为28°C，诱导表达时的细胞浓度OD6c?为0.6，诱导表达时间为1h ；
[0011]本发明提供的生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于所述的重组微生物催化效率与酶活力存在特定的关系，优化后的酶活力比值为3:1 (N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶:N-乙酰神经氨酸醛缩酶)，所述的催化反应底物N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠的浓度分别为0.6M 和 1.6M，Triton X-100 浓度为 0.4%，反应温度 30_35°C，反应时间在 48_60h。
【附图说明】
[0012]图1为重组质粒pET_28a (+)-nanA酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。
[0013]图2为重组质粒pET_28a (+)-sir酶切验证琼脂糖凝Jj父电泳图。
[0014]图3为产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌中N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白的电泳检测结果。
[0015]图4为全细胞催化产N-乙酰神经氨酸底物浓度优化结果。
【具体实施方式】
[0016]实施例1、重组质粒pET-28a(+)_slr的构建
[0017]根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)AGE 编码基因 slrl975 (ID:954945)序列，利用 E.coli Codon Usage Analysis 2.0软件对该序列进行密码子分析和优化。根据优化后的DNA序列合成目的基因，该基因命名为slrl975*。目的基因合成时在两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，合成后插入载体质粒pET-28a(+)多克隆位点EcoRI和NdeI之间。
[0018]
[0019]用于扩增slrl975* 基因的引物:SlrF:5’ -GGAATTCCATATGATGATTGCCCATCGCCGTCA-3’ ；SlrR:5’-CCGGAATTCTTAAGAAACCGGCAGTTGC-3’
[0020]N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因是利用人工合成基因slrl975*作为模版进行PCR扩增而得。将slrl975*基因片断和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和