人类aldh2基因检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人类ALDH2基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙醛脱氢酶2 (ALDH2)在人体的酒精代谢过程中起到重要作用。当人摄入酒精后， 体内的乙醇脱氢酶首先将其氧化为乙醛，然后通过ALDH2把乙醛进一步转化成为乙酸。乙 醛对身体有较强的毒性，一旦乙醛脱氢酶发生突变，将会影响身体降解乙醛的效率，导致乙 醛在体内累积，从而引发身体不适，长此以往将会造成对肝脏、肾脏和心脏的负担，从而引 发各类疾病。有研宄表明，乙醛脱氢酶2的突变与各类消化道癌症的关系密切。同时，乙醛 脱氢酶2还是有效代谢硝酸甘油的关键，而乙醛脱氢酶2突变的人群服用硝酸甘油无效风 险大幅增加，所以在服用硝酸甘油前需要进行乙醛脱氢酶2基因检测，如果检测结果表明 受检者服用硝酸甘油无效，则需要改用其它药物。
[0003] 现有技术中，已有检测ALDH2基因突变的技术。例如：（1)采用基因芯片的方法进 行ALDH2基因突变检测，该技术在野生型和突变型的碱基差异位置设计寡核苷酸序列，通 过是否能与芯片杂交来判别检测对象为野生型还是突变型。基于基因芯片的技术步骤繁 琐，每个样本的处理时间较长，很难进行大样本量的批量处理，而且单次检测的成本较高， 同时还需要芯片扫描仪来进行诊断，需要购置额外的检测设备。（2)采用一代测序的方法 来区分野生型和突变型，所述技术需要一代测序仪进行测序，同时实验周期较长。（3)采用 QPCR的方法来区分野生型和突变型，但是所述技术需要QPCR仪进行测序，操作复杂。（4) 用特异性的引物进行PCR来区分野生型和突变型，但是所述技术的准确率低。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于，提供一种检测快速、准确率 高、操作简单、成本低的ALDH2基因检测试剂盒。
[0005] 本发明的另一目的在于，提供所检测试剂盒应用及其使用方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明的第一方面，提供了一种ALDH2基因检测试剂盒，包括野生型和突变型 ALDH2基因特异性扩增引物对以及TspRI限制性内切酶。
[0008] 优选地，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，具体为：5' -TGTAACCCATAACCCCCAAG-3';反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 所示，具体为：5' -AAACACTGATGGCCTCAAGC-3'。
[0009] 本发明试剂盒的关键是所述引物对和所述限制性内切酶的首次组合使用。本发明 的发明人经过反复比较和优化，获得了所述能同时扩增野生型和突变型ALDH2基因的引物 对。根据野生型和突变型ALDH2基因的单碱基差异位点，设计了所述TspRI限制性内切酶， 野生型ALDH2基因能够被所述限制性内切酶识别并消化，而突变型ALDH2基因对所述限制 性内切酶不敏感，因此不能够被识别消化。将消化后的产物直接进行电泳，若电泳结果只有 一个完整的400bp左右的条带，则说明受试者的ALDH2基因的两个拷贝都不能被TspRI限 制性内切酶消化，为纯合突变型ALDH2基因；若电泳结果有两个被消化的条带，则受试者的 ALDH2基因的两个拷贝均能够被TspRI限制性内切酶消化，为野生型ALDH2基因；若电泳结 果有三个条带（其中有一条400bp左右的未被消化的条带以及两条被消化的条带），则受试 者的ALDH2基因有一个拷贝能够被TspRI限制性内切酶消化，一个不能够被TspRI限制性 内切酶消化，为杂合突变型ALDH2基因。
[0010] 基于本发明的所述试剂盒采用的是PCR来进行定量检测，所述试剂盒中还可以包 括其他一些试剂，如：总DNA抽提试剂、PCR试剂、PCR产物纯化试剂、凝胶电泳试剂以及对 照品中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。
[0011] 所述总DNA抽提试剂可采用各种常规的抽提DNA的试剂，这些试剂可市购获得。
[0012] 所述PCR试剂可采用各种常规的PCR试剂，这个试剂可市购获得。
[0013] 所述PCR产物纯化试剂可采用各种常规的PCR产物纯化试剂，这个试剂可市购获 得。
[0014] 所述对照品包括野生型ALDH2基因阳性对照样品、纯合突变型ALDH2基因阳性对 照样品、杂合突变型ALDH2基因阳性对照样品。
[0015] 所述试剂盒还包括阴性对照品，所述阴性对照品为CldH2O。
[0016] 此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书，便于本领域技术人员使用。
[0017] 进一步的，本发明的第二方面，还提供了一种前述试剂盒的使用方法，包括步骤：
[0018] (1)待测DNA样品的制备：采用经典的基因组DNA提取方法或是商品化的基因组 提取试剂盒，从样本中提取基因组DNA备用；
[0019] (2)配置PCR反应体系：将待测DNA样品、野生型ALDH2基因阳性对照样品、纯合 突变型ALDH2基因阳性对照样品、杂合突变型ALDH2基因阳性对照样品、ddH20分别加入装 有含2倍PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、野生型和突变型ALDH2基因特异性扩增引物对的 PCR管，并加 ddH20补足体积，盖好管盖，组成PCR反应体系；
[0020] (3) PCR扩增：对步骤（2)的PCR反应体系进行PCR扩增；
[0021] (4) PCR产物纯化：对步骤（3)所得PCR产物进行纯化；
[0022] (5)限制性内切酶消化：用TspRI限制性内切酶对步骤⑷纯化后的PCR产物进 行消化；
[0023] (6)凝胶电泳：对步骤（5)限制性内切酶消化后的产物直接进行琼脂糖凝胶电 泳；
[0024] (7)结果分析：按上述条件进行检测结果判断。
[0025] 较优的，步骤（1)中，所述的样本来源于受试者的唾液。
[0026] 较优的，步骤（2)中，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 3所示，具体为：5' -TGTAACCCATAACCCCCAAG-3';反向引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示，具体为：5' -AAACACTGATGGCCTCAAGC-3'。
[0027] 除了采用本发明的引物，本发明对PCR反应体系中其它各组分及其终浓度没有特 别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR反 应体系。用于PCR扩增的模板（如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。
[0028] 本发明的第三方面，还提供了前述试剂盒在制备ALDH2基因检测试剂中的用途。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0030] 本发明的核心创新点在于发现了一个ALDH2基因上的限制性酶切位点，可以通过 "能否被限制性内切酶消化"来判别突变型和野生型，只需要常规的PCR和凝胶电泳技术就 可以实现对ALDH2基因的突变位点检测。不需要额外购买测序仪、QPCR仪或芯片扫描仪， 可以在大量普通的分子实验室开展检测。同时，与其它检测方法相比，本发明还有快速、便 宜、稳定和准确的特点，具有全面的优势。
[0031] 概括起来，本发明具有如下优势：
[0032] (1)只要基本的PCR仪和电泳设备就能完成检测，不需要依赖QPCR仪、测序仪和芯 片扫描仪等设备，有利于检测的普及；
[0033] (2)步骤简单，DNA抽提、PCR、内切酶消化和凝胶电泳，都是最基本的分子生物学 技术，有利于检测的稳定和标准化；
[0034] (3)成本低；
[0035] (4)周期短，能够在4个小时内完成检测。
【附图说明】
[0036] 图I :ALDH2野生型和突变型基因的差别示意图。
[0037] 图2 :实施例2检测结果，待测样品1和2中存在纯合突变型ALDH2基因；待测样 本3和4中存在杂合突变型ALDH2基因；待测样品5和6中存在野生型ALDH2基因。
【具体实施方式】
[0038] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0039] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个