Mait样细胞及其制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及由MAIT细胞制作人工多能干细胞的方法、以及MAIT细胞来源的人工 多能干细胞。另外，本发明涉及由人工多能干细胞制作MAIT样细胞的方法、以及由此得到 的MAIT样细胞。
【背景技术】
[0002] MAIT 细胞（Mucosal associated invariant T cells，粘膜相关的恒定 T 细胞） 可产生各种细胞因子以控制各种免疫反应，是作为承担自然免疫和获得免疫的"桥梁作用" 的细胞而已知的自然免疫T淋巴细胞的一种。MAIT细胞在人中丰富地存在，例如在肝脏中 的T细胞中占20-50%，占肠道粘膜淋巴细胞固有层（lamina propria lymphocytes :LPL) 或外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells :PBMC)的 1-10%，另一方面， 在小鼠中为稀有的细胞（Dusseaux et al.，2011 ;Le Bourhis et al.，2011)。
[0003] 作为MAIT细胞的另一特征，可以举出T细胞受体（T cell rec印tor :TCR)的单 一性。T细胞特异性表达的TCR将与主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex :MHC)分子结合的肽片段作为抗原进行识别。TCR由在细胞表面表达的两个多 肽链、a链和|3链构成，两条链均在N末端的抗原结合区针对被称为可变（variable: V)区的每个TCR分子具有氨基酸序列不同的部位，该V区的多样性决定了免疫反应中的 T细胞的抗原特异性。TCR的V区与免疫球蛋白同样地由包括多个亚型的V(Variable)、 D (Diversity)、J (Joining)基因片段构成，a链中V和J的各1个片段通过DNA重组而结 合，0链中V、D、J的各1个片段通过DNA重组而结合，形成了编码该区域的基因。
[0004] 另一方面，在T细胞中，作为其TCR未呈多样性的单一的细胞，已知自然杀伤T细 胞（Natural killer T cells :NKT细胞）和MAIT细胞这两种。在人的情况下，MAIT细胞 的TCRa链仅为Va7. 2_Ja33的组合，在NKT细胞的情况下，其组合为Va24_Ja 18(Le Bourhis et al.，2011)。另外，在小鼠的情况下，MAIT细胞的TCRa链仅为Val9_Ja33 的组合，在NKT细胞的情况下，其组合为V a 14-J a 18。对两细胞的TCR来说，能够结合的 抗原呈递分子（约束性）也不同，MAIT细胞的TCR识别?结合与一般的T细胞中的抗原 呈递分子MHC类似的、无多样性的MR1 (MHC-相关分子-1)，在NKT的情况下，将MHC类似的 (Did (cluster of differentiation (分化群）-Id)作为抗原呈递分子。MAIT细胞特异性 的TCR和MR1以进化良好的方式被保存，暗示了在广泛物种中的功能重要性（Le Bourhis et al. , 2011) 〇
[0005] MAIT细胞在表达上述invariant TCRa链的同时，作为特异性的表面抗原标记 分子而表达作为C型凝集素的⑶161(别名，natural killer cell surface protein(自 然杀伤细胞表面蛋白）：NKRP1)和白细胞介素（IL)-18受体a链（IL_18Ra) (Cosmi et al.，2008 ;Le Bourhis et al.，2010)。即，MAIT细胞可以与CD3等一般性的T细胞标记物 一同作为表达MAIT特异性的invariant TCRa链、⑶161、IL_18Ra的细胞来进行规定。另 外，MAIT细胞呈现出⑶45RA\⑶45R0+、⑶95high、⑶62L 1?等效应/记忆型T细胞的性状，同 时由于趋化因子受体的表达为CCR9int、CCR7' CCR5high、CXCR6high、CCR6high，因而暗示了向肠 道或肝脏等的归位指向性Ousseaux et al.，2011)。
[0006] 另外，据报道：MAIT细胞在产生干扰素（IFN)y、IL-17、IL-2等细胞因子、或颗 粒酶B的同时，几乎不显示出增殖性，表达多药耐药性转运体ABCB1而显示出多药耐药 性（Dusseaux et al.，2011)。通过这些特性，暗示了 MAIT细胞对于肠内细菌产生的异物 具有抵抗性，和/或参与生物体内的感染防御系统。事实上，据报道MAIT细胞是与感染 结核菌等细菌或真菌的细胞发生反应的特殊的T细胞，同时在结核等的细菌感染患者中 发现了 MAIT细胞的减少，并且由使用了小鼠的模型实验表明，MAIT细胞防御脓肿分枝杆 菌（Mycobacterium abscessus)、大肠杆菌（Escherichia coli)的感染（Le Bourhis et al.，2010 ;Gold et al.，2010 ;Dusseaux et al.，2011)。由以上的结果推测了 MAIT细胞作 为针对细菌感染的自然免疫淋巴细胞的功能。
[0007] 此外，MAIT细胞暗示了与以多发性硬化症为代表的自身免疫性疾病、炎症性疾病、 癌的发病和发展的相关性。CD8+/CD161 highT细胞集聚于肝脏或关节等的炎症部位，是被认 为是多发性硬化症的发病原因的T细胞群，表明，在人PBMC中CD8+/CD161 highT细胞的90% 为作为MAIT细胞特异性的TCR a链的V a 7. 2+(Walker et al.，2011)。进而，据报道，在 多发性硬化症患者中其病变部集聚有更多的MAIT细胞（Illes et al.，2004;Miyazaki et al.，2011)。还有报道称，MAIT细胞的集聚为肾癌或脑肿瘤（Peterfalvi et al.，2008)、慢 性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（Illes et al.，2004)。另外，关于以溃疡性结肠炎或克隆 病为代表的炎症性肠疾病，据报道，引入的MAIT细胞对药物引起的炎性组织损伤具有保护 作用（Xiao Ruijing et al.，2012)。
[0008] 这样，MAIT细胞被暗示参与各种疾病或病状，但现状是，关于免疫控制机制、特别 是自然免疫中的作用及其详细的机理、有助于其的因子及分子、进而在病状发病和发展中 的意义等，还未进行充分的研宄和分析。作为其重要的原因之一，可以举出能够供体外（in vitro)及体内（in vivo)试验的细胞来源的问题。
[0009] 如上所述，在作为实验用动物而频繁使用的小鼠中，MAIT细胞是非常稀有的细胞 群，难以使用该动物进行功能分析。另一方面，与小鼠相比，MAIT细胞在人中丰富地存在，但 是由外周血等人生物体试样大量制备MAIT细胞存在界限。另外，在这种方法中，所得到的 MAIT细胞的数量及性质发生大幅变动的可能性也高，使用该细胞的试验的稳定性和再现性 存在困难。进而，MAIT细胞通常为几乎不具有细胞增殖能力的状态，而且诱导其增殖的因 子及刺激未被确定，因此在in vitro条件下无法增殖（Dusseaux et al.，2011)。所以，作 为为了广泛进行使用MAIT细胞的研宄的一个解决方案，例如考虑了利用与MAIT细胞功能 类似的模型细胞，但现状是几乎不知道具有这种特性的细胞株。
[0010] 另外，作为MAIT细胞的未来的活用法之一，考虑在罹患各种感染症或自身免疫性 疾病、癌的患者中引入MAIT细胞或经人工修饰的MAIT细胞来进行治疗，即作为所谓细胞移 植疗法中使用的细胞源进行利用。但是，为了实现该治疗法，依然需要确立具有稳定品质 的、可制备大量的MAIT细胞的方法。
[0011] 近年来，作为在生物体外制备各种细胞的方法，广泛地进行了下述尝试：将多能干 细胞用作原始细胞，分化诱导该细胞而制作出目标细胞。多能干细胞（pluripotent stem cells)是指如下定义的细胞：通过试管内培养而保持未分化状态，在此状态下能够几乎 永久或长期地进行细胞增殖，呈现出正常的核（染色体）型，在适当条件下具有分化成所 有三胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的家谱的细胞的能力。作为多能干细胞，可以举出 由早期胚胎分离的胚胎干细胞（embryonic stem cells :ES细胞）或由胎儿期的原始生 殖细胞分离的胚胎生殖细胞（embryonic germ cells)、由刚出生后的精巢分离的生殖干 细胞（germline stem cells)、进而通过特殊的基因操作由成纤维细胞等体细胞制作的人 工（诱导）多能干细胞（induced pluripotent stem cells;下文中称为iPS细胞）等 (Lengner, 2010 ；Pfannkuche et al, 2010 ;0kita and Yamanaka, 2011) 〇
[0012] 关于由多能干细胞制作血细胞系细胞或淋巴细胞系细胞的事例有许多报道，选 择性地制作出T细胞的方法也是公知的。即，在以未分化状态维持ES细胞或iPS细胞等 多能干细胞后，接种于具有造血细胞维持能力的基质细胞（例如0P9细胞）上，诱导向 造血干细胞和造血祖细胞的分化，对其进行回收后，接着在强制表达作为Notch配体的 delta-like-1 (DLL1)的0P9细胞（0P9/DLL1)上可以制作出具有作为T细胞的特性的细胞 (Schmitt et al.，2004 ;Timmermans F et al.，2011)。另外还报道了下述方法：对于由小 鼠NKT细胞制作的iPS细胞，通过使用该0P9共培养体系，制作具有作为NKT细胞的特性的 细胞（W02008/038579 ;Wakao H et al.，2008 ;W02010/027094 ;Watarai et al.，2010) 〇
[0013] 现有技术文献
[0014] 专利文献
[0015] 专利文献 1 :TO2008/038579
[0016] 专利文献 2 :TO2010/027094
[0017] 非专利文献
[0018] 非专利文献 1 :Dusseaux et al.，Blood 117, 1250-1259(2011)
[0019] 非专利文献 2 :Le Bourhis et al.，Trends in Immunol. 32, 212-218 (2011)
[0020] 非专利文献 3 :Cosmi et al.，J. Exp. Med. 205, 1903-1916,（2008)
[0021] 非专利文献 4 :Le Bourhis et al.，Nat. Immunol. 11，701-708(2010)
[0022] 非专利文献 5 :Gold et al.，PLoS Biol. 8, e100 0407 (2010)
[0023] 非专利文献 6 :Walker et al.，Blood 119,422-433(2011)
[0024] 非专利文献 7 :Illes et al.，Int. Immunol. 16, 223-230(2004)
[0025] 非专利文献 8 :Miyazaki et al.，Int. Immunol. 23, 529-535 (2011)
[0026] 非专利文献 9 :Peterfalvi et al.，Int. Immunol. 20, 1517-1525 (2008)
[0027] 非专利文献 10 :Xiao Rui j ing et al.，Hepatogastroenterolo gyll5, 762-767(2012)
[0028] 非专利文献 11 :Lengner CJ, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1192,38-44(2010)
[0029] 非专利文献 12 :Pfannkuche K et al. , Cell Physiol Biochem. 26, 105-24(2010)
[0030] 非专利文献 13 :0kita and Yamanaka, Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci. 366, 2198-2207(2011)
[0031] 非专利文献 14 :Schmitt et al. , Nat. Immunol. 5, 410-417 (2004)
[0032] 非专利文献 15 :Timmermans et al. , J. Immunol. 182, 6879-6888 (2011)
[0033] 非专利文献 16 :Wakao et al. , FASEB J. 22, 2223-2231 (2008)
[0034] 非专利文献 17 :Watarai et al. , J. Clin. Invest. 120, 2610-8 (2010)
【发明内容】
[0035] 发明要解决的问题
[0036] 在T细胞中，作为其TCR未呈多样性的单一（invariant，恒定）的细胞，已知NKT 细胞和MAIT细胞这两种。NKT细胞在对细菌或癌进行个体防御方面起到重要的作用，同时 在自我免疫性疾