一种mrc-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品领域，涉及一种培养基的配置和使用方法，更具体的，涉及一 种使用生物反应器培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基。
【背景技术】
[0002] 人体二倍体细胞是指正常人体组织在体外培养的细胞。细胞株来源于正常人胚胎 或者其他组织的细胞群体，其染色体数目与原供体细胞染色体数目相同，为二倍体，在正常 情况下具有有限生命期，是有限生命细胞株。由于人二倍体细胞为正常核型细胞，无致癌 性，无外源因子污染，而且具有高免疫原性和良好的耐受性，对病毒敏感谱广，所以在培养 病毒和制备病毒类疫苗方面价值很大。以人二倍体细胞制备得到的狂犬病疫苗为例：人二 倍体细胞狂犬病疫苗的抗体应答速度更快，相同时间内产生的免疫保护更显著，且免疫持 久性，有报道表明，接受此疫苗注射后32年仍可检测到狂犬病抗体的免疫记忆反应。同时， 在临床应用方面，很多研宄表明人二倍体细胞狂犬病疫苗有着很好的安全性，不论在体液 免疫还是细胞介导的免疫应答中都能产生迅速和有效的免疫保护。
[0003] 目前在国内外生物工程生产中普遍应用的人二倍体细胞株主要包括:MRC-5细胞 株，KMB-17细胞株和2BS细胞株。
[0004] MRC-5细胞株是英国于1966年由一个14周龄的人工流产男性胎儿的肺组织建立 的，有限生命为48代。经鉴定认为该细胞株可用于疫苗生产，随后MRC-5细胞株被确定为国 际参考株，取代因种子细胞被发现在更早次代受到污染而无法成为生物制药用株的WI-38 细胞株。现在，法国、美国等发达国家均在病毒疫苗领域广泛使用MRC-5细胞株。
[0005] 在我国，尚未有应用MRC-5细胞株制备而得的病毒疫苗产品。同时，在研发和生产 领域，人二倍体细胞的培养在培养基的选用、优化，和如何实现大规模培养（例如使用生物 反应器）方面多年来存在一定困难，有待进一步深入研宄。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种适用于在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养 基及其使用方法。使用本发明所述的培养基，以较低血清浓度（5% -10% )，在生物反应器 中对MRC-5细胞进行大规模培养。接种狂犬病病毒后，继续使用本发明所述的培养基用来 维持病毒在细胞液中的增殖。本发明提供的培养基及其使用方法，使MRC-5细胞高效贴附 在微载体上，细胞生长过程中生长速度快，细胞形态好，在灌流培养方式下可以在3-5天内 达到较高密度；接种狂犬病病毒后，在维持培养基培养下，可以连续收获病毒液5天。
[0007] 本发明的一种在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基，其组成 成分及重量份为：
[0008] 成份 mg/L 甘氨酸（Glycine) 20-45 L-丙氨酸（L-Alanine) 28一40 L-盐酸精氨酸(L-Arginine hydrochloride) 80-120 L-天门冬氨酸（L-Aspartic acid) 35-55 L-盐酸半胱氨酸（L-Cysteine hydrochloride-ftO) 2-12 L-盐酸胱氨酸 50-90 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 80-120 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 110-260 L-盐酸组氨酸(L-Histidine) 45-75 L-轻脯氨酸(L-Hydroxyproline) 2-8
[0009] L-晃亮氨酸（L-Isoleucine 55-100 L-亮氨酸（L-Lcucinc) 80-118 L-盐酸赖氨酸(L-Lysirie hydrodiloride) 40-68 L-甲硫氨酸（L-Methionine) 16-29 L-苯丙氣酸（Phenylalanine) 33-49 L-丝氨酸（L-Serine) 26-49 L-苏氨酸(L-Threonine) 49-59 L-色氨酸（L-Tryptophan) 21-31 L-缬氨酸(L-Valine) 52-72 L-脯氨酸(L-Proline) 40-80 L-酿氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate 35-50 氯化钠 （Sodium Chloride) 6900-7500 无水硫酸镁（Magnesium Sulfate (anhydrous) ) 100-120 氯化钾（Potassium Chloride) 410-600 无水氯化?丐〔Calcium Chloride) 120-178 一水麟酸氛二納（Sodium Phosphate mnnnbasi'c) 7〇-l 00 五水硫酸铜（Cupric sulfate) 0.005-0.01 i之酸4? (D-Calcium pantothenated) 0. 05_0. 4 氯化胆减（Choline chloride) 2-10 叶酸(Folic Acid) I. 1-1. 3 肌醇（i-Inositol) 0. 8-1. 2 烟酰胺（Niacinamide) 0· 05-0. 4 核黄素 (Riboflavin) 0. 15-〇. 35 盐酉變石荒胺(Thiamine hydrochloride) 1.2-2. 4 葡萄糖（D-(Glucose (Dextrose)) 2000-5000 酚红（Phenol Ked) 12-18 盐酸批够签 CPyridoxal hydraohlori da) 0.01-(102 盐酸吡眵醇 0.04-0.07 维生素 B12 (Vitamin B12) 0. 7-1. 5 维生素 B6 (Vitamin B6) 0. 001-0.1 抗坏血酸（Ascorbic Acid) 0.08-0.3 亚油酸(Linoleic Acid) 0.05-0.4 维生素 D2 (Vitamin D2) 0. 012-0. 018 维生素 K (Vitamin K) 0.019-0. 038 维生素 Λ (Vitamin Λ) 0. 15-0. 25 维生素 C ( Vitamin C) 0· 06-0. 08 烟酸 0. 03-0. 04 硫酸腺卩票呤（Adenine sulfate) 7. 2-9. 3 腺嘌呤三磷酸 2, 1-4, 2 盐酸鸟嘌呤（Guanine. HCL) 0. 4-Q. 6 次黄嘌呤（Hypoxanthine) 0. 4-0. 6 还原谷胱甘肽 0.06-0. 1 胸腺嘧啶（Thymine) 0. 4-0. 6 尿嘧啶（Uracil) 0.4-0. 6 黄嘌呤钠盐 0. 4-0. 6 脱氧核糖 0. 6-α 8 核糖 0. 6-0. 8 胆固醇（Cholesterol) 0. 3_0· 7 吐温-80 (Tween-80) 5. 5~6. 5 胰岛素 5.5-8. 5。
[0010] 上述培养基的组成成分及重量份优选为：
[0011] 成份 mg/L 甘氨酸（GlyuintO 30 L-内氣酸（L-Alanine) 34 L-盐酸精氨酸(L-Arginine hydrochloride) 100 L-天门冬氨酸（L-Aspartic acid) 45 L-盐酸半U光氨酸（L-Cysteine hydrochloride-H2O) 7 L-盐酸胱氨酸 70 L-谷氣酸(L-Glutamic Acid) 100 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 180 L-盐酸组氨酸(L-Hi st idine) 60 L-轻脯氨酸(L-Hydroxyproline ) 5 L-异壳氨酸(L-Isoleucine 75 L-亮氨酸(L-Leuc ine ) 98 L-盐酸赖氨酸(L-Lysine hydrochloride) 54 L-甲硫氨酸(L-Methionine ) 21 L-苯丙氨酸（Phenylalanine) 41 L-丝氨酸(L-Serine) 38 L-苏氨酉$ (L-Threonine) 54 L-色氨酸(L-Tiyptophan) 26 L-織氨酸(L-Valine) 62 L-腩氨酸(L-Prol ine) 60 赂氨酸盐钠盐二水（丨厂Tyrosi'ne di'sodi'um salt diInydmte 45. 5 氯化钠 （Sodium Chloride) 7200 无水硫酸樣（Magnesium Sulfate (anhydrous) ) HO 氯化钾（Potassium Chloride) 500 无水氯化轉（Calcium Chloride) 150 一水f粦酸氢二钠 （Sodium Phosphate monobasic) 85 五水硫酸铜 CCuprie suiraLe) 0. 008 泛酉爱,? (D-Calciura pantothenated) 0. 2 氯化胆减（Choi ine cliloHde) 6 叶酸(Folic Acid) I. 2 肌醇（i-Inositol) i 烟酰胺（Niacinamide) 0.2 核黄素 (Riboflavin) 0. 25 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1.8 蔔萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 3500 酚红（Phenol Red) 15 盐酸吡眵签(Pyridoxal hydrochloride) 0. 015 盐酸吡哆醇 0. 05 维生素則2 (Vitamin B12) Li 维生素 B6 (Vitamin B6) 0. 005 抗坏血酸（Ascorbic Acid) 0· 19 亚油酸(Linoleic Acid) 0. 21 维生素 D2 (Vitamin D2) 0.015 维生素 K (Vitamin ]〇 0.028 维生素 A (Vitamin A) 0.2 维生素 C (Vitamin C ) 0.068 烟酸 0.035 硫酸腺嘌呤（Adenine sulfate)