用于制备pap固体反应成分的冷冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和核酸扩增领域，尤其是用于制备PAP固体反应成分的冷 冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用。
【背景技术】
[0002] 现阶段用于核酸扩增的技术包括焦磷酸化激活性聚合反应（PAP)。PAP是通过使 用3'末端阻断性引物，由DNA聚合酶把焦磷酸化反应和聚合反应串联耦合的一种核酸扩 增方法。引物在其3'末端被一个不可延伸的核苷酸（3'末端阻断剂）所阻断，如双脱氧 核苷酸，而不能被DNA聚合酶直接延伸。当3'末端阻断性引物退火与其互补的DNA模板相 配时，在焦磷酸或其类似物存在的条件下，DNA聚合酶可以将3'末端阻断性引物的3'阻断 剂除掉，这一反应称为焦磷酸化。然后DNA聚合酶可将结合到DNA模板上3'末端已解除阻 断的引物进行延伸。此外，PAP已经在美国专利号6, 534, 269, 7, 033, 763, 7, 105, 298, 7, 23 8, 480, 7, 504, 221，7, 914, 995, and 7, 919, 253 有所描述。
[0003] PAP使用了 3'末端阻断性引物串联耦合了焦磷酸化反应和延伸性聚合反应而产 生了非常高的选择性，因为一个显著的非特异性扩增（第二类错误）需要不匹配性焦磷酸 化反应并加上随后由DNA聚合酶延伸掺入错误匹配的脱氧核苷酸，这类串联耦合事件的发 生概率极低，估计为3. 3 X KT11。
[0004] 双向形式的PAP (双向PAP)使用两个相反方向的3'末端阻断性引物并在其3'末 端有一个核苷酸相互重叠，双向PAP特别适合于等位基因的特异性扩增。在IO 9个拷贝的 野生型DNA存在的条件下，双向-PAP能够检测出单一拷贝的突变型等位基因而没有假阳性 扩增。
[0005] DNA-PAP是指从DNA模板开始的PAP扩增。对于DNA-PAP的相关报道表明，PAP最 初的测试使用了 Tf 1和Taq聚合酶于人类多巴胺Dl基因 DNA模板，证明了 DNA依赖性DNA 焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合的原理。在用于其它DNA模板的情 况下，还证明了使用一个由基因工程技术优化后含F667Y突变的聚合酶TaqFS时，PAP的效 率大大提尚。
[0006] 而RNA-PAP是指从RNA模板开始的PAP扩增。对于RNA-PAP的相关报道则表明， RNA-PAP的发明可以直接扩增RNA模板而无需额外的处理。RNA-PAP带来了一个RNA模板扩 增的新机理，当阻断性引物退火杂交至RNA模板上时，RNA依赖性DNA聚合酶焦磷酸化反应 除掉：V阻断剂，例如Y双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合酶将活化的引物延伸。 同样由于这种串联耦合，RNA-PAP具有很高的选择性来对抗RNA模板的不匹配，提供了高度 特异的RNA模板的扩增（美国专利申请公开号20140186840)。
[0007] 冷冻干燥是一个将材料冷冻然后降低周围压力使材料中的冰直接从固相到气相 升华的脱水过程。这一工艺被用于稳定逆转录酶和RNA聚合酶（美国专利号5614387)，冻 干式PCR试剂（美国专利号5861251,6153412, WO专利申请公开号2005103277, EP专利号 2202302)，和干燥式荧光Sanger测序分析试剂（美国专利号7407747)。然而，在多种组成 成分存在的情况下，因为成分之间脆弱的平衡和相互作用，冻干的结果基本上是不可预知 的。例如，据报道含有引物的干燥后的混合物可使Taq聚合酶失活（EP专利号2202302)，及 镁离子引发的非特异性反应导致假阳性扩增。
[0008] 另外在实际工作中，PAP组合物以多种水溶液形式分别存储，包括反应缓冲液、焦 磷酸、dNTPs、3'阻断性引物、聚合酶、及核酸模板等均被存储在多个不同的试管内。操作时 需要把PAP的各个组分从不同的试管移液加入到一个试管内，该操作过程既容易出错且相 当费时。
[0009] 可见，寻求一种PAP组合物冷冻干燥技术具有非常重要的应用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题在于提供用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技 术。
[0011] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述液体集成组合物通过冷冻干燥 技术所获得的固体集成组合物。
[0012] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述固体集成组合物的应用。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0014] 用于制备固体PAP反应成分的冷冻干燥技术，包括：
[0015] a)提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3'阻断性引 物、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖；
[0016] b)将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得固体集成组合物，使其易 于存储和操作；其中，
[0017] 所述液体集成组合物的水溶液包括：反应缓冲液包含有Tris-HCl、（NH4) 2SO4、和 Mg++;脱氧核苷三磷酸和焦磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na 407P2或其类似物；荧光染料是 SybrGreen I或连接于引物上的FAM ;聚合酶是含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；所述 非还原性双糖包括有海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖。
[0018] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有牛血清白蛋白。
[0019] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0020] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。
[0021] 优选的，上述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术，所述通过冷冻干燥技 术获得PAP固体集成组合物的方法还进一步包括步骤：c)冷冻干燥后，加入液体性核酸模 板水溶液使得冷冻干燥获得的固体集成组合物溶解。
[0022] 优选的，上述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术，具体步骤如下：
[0023] (1)准备水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM Tris-HCl (pH值8. 0， 25°C )、20-40mM(NH4)2S04、2. 4-10mM MgCl2、50 或 90 或 100 或 180 μΜ 的每一种 dNTP(包括 (^丁卩、(1111\(?^13和(1〇13)、0.2-0.4以]\1每种引物、180-36(^]\1恥4??丨，0.2-0.4\571^6代611 I 染料，〇· 02-0. 04% Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM 海藻糖，0-0· 4% 聚蔗糖-400， 50-100g/ml BSA，和 0· 5-lmM DTT ;
[0024] (2)冷冻干燥过程，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，具体条件为：在_50°C至_55°C 快速冷冻2-4小时后，将样品抽至0-15帕压力真空并保持在-40°C至_45°C、15-30小时，然 后逐渐升高温度至室温，例如在-20摄氏度运行1小时，在5°C运行1小时，在30°C运行1 小时。
[0025] 由上述冷冻干燥技术所获得的固体集成组合物，由上述冷冻干燥技术制备而得。
[0026] 优选的，上述固体集成组合物，具有组分如下：
[0027] 反应缓冲液成分，包括 Tris-HCl、（NH4)2SO4、和 Mg++;
[0028] 脱氧核苷三磷酸和焦磷酸，为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na4O 7P2或其类似物；
[0029] 荧光染料，是SybrGreen I或连接于引物上的FAM ;
[0030] 聚合酶，是含有F66