外源基因转化浮萍并进行表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其是一种将外源基因快速高效转化入浮萍并进行表 达的方法。
【背景技术】
[0002] 浮萍为单子叶水生漂浮植物，为最小的开花植物之一。因其结构简单，增殖快，不 仅被广泛应用于植物生理学、遗传学、生态学和环境检测等方面，而且被广泛应用于水体污 染的治理。实验室培养的浮萍叶状体从分生细胞处以类似于酵母无性繁殖的营养出芽方式 快速增殖，因此遗传非常稳定；浮萍生物量平均每2-3天繁殖1代，生物量增加快，生产周期 短；表达产物产量高且容易分离纯化；浮萍可用来生产在细菌和酵母中不易表达的复杂蛋 白质，浮萍还可用来表达在哺乳表达系统受限或耗资太高的蛋白；严格的无菌培养使其不 易受病毒的感染，其表达的疫苗安全性高；浮萍相对于其他植物来说不需要田地来进行种 植生长，可通过采用野外有营养的废水来低廉生产有价值的融合蛋白或肽，而且还能净化 废水供再利用；浮萍可在发酵罐或生物反应器中生长，使其更容易整合入现存的蛋白质生 产工业基础建设中；因此采用浮萍作为植物生物反应器系统在生产重组蛋白方面具有良好 的应用前景。
[0003] 目前已经有两种浮萍成功开发为商业化生物反应器，分别是美国BIOLEX公司的 LEX SystemTM表达系统和法国LemnaGene公司的LemnaGeneTM SA表达系统，二者价格都很 昂贵。国内以浮萍作为表达系统还未见报道。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供一种外源基因转化浮萍并进行表达的方法，包括如 下步骤：
[0005] 步骤一：将外源基因转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；然后配制农杆菌重悬液；
[0006] 步骤二：在所述浮萍叶状体区域割划若干处，然后将所述割划后的浮萍叶状体在 所述农杆菌重悬液中浸泡l〇-15min，通过所述重组农杆菌将所述外源基因生长到所述浮萍 叶状体中；然后将所述浮萍叶状体移植入铺有无菌滤纸的共培养基中，室温下避光培养3 天以上。
[0007] 优选地，所述农杆菌重悬液的配制步骤为：挑取重组农杆菌单菌落在YEB固体培 养基上活化；活化完成后的重组农杆菌单菌落再接种到YEB液体培养基中，26~30°C生长 过夜，获得重组农杆菌菌液；然后按照体积比为1:50~100将所述重组农杆菌菌液接种于 含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液体培养基中形成接种 液，于26~30°C振摇至使所述接种液在波长为600nm的吸光度值为I. 0 ;最后将所述接种 液重悬于含3%蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0. 6M甘露醇的1/2MS固体培养基中，得到农杆 菌重悬液。
[0008] 优选地，所述步骤二还包括对浮萍的预处理：在SH培养基含1 %蔗糖和10 μ M吲 哚乙酸中于23°C，在光生物反应器中16h光照/8h黑暗，40 μ mol/m2 .sec预培养2周以上。
[0009] 优选地，还包括一正交试验，即选用抗生素水溶液，浓度分别为0、5、10、20和 40mg/L ;每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次；植物激素水溶液，浓度分别各为0、 0. 5、1、2和5mg/L ;每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次，通过分析极差值找出未 经过转化的浮萍在抗生素、植物激素影响下的最佳生长条件。
[0010] 优选地，所述农杆菌重悬液中所述重组农杆菌的浓度为lX108cfu/ml~ I X 109cfu/ml 〇
[0011] 优选地，所述外源基因为pcambia-1300-GFP双元质粒；所述农杆菌为EHA105。
[0012] 有益效果：
[0013] 1、本发明选用pcambia-1300-GFP双元质粒作为外源基因的载体重组农杆菌 EHA105,该载体具有插入片段长，转化效率高的特点，能够很方便地将复杂的外源基因整合 到载体上；
[0014] 2、本发明采用pcambia-1300-GFP双元质粒作为外源基因的载体，该载体表达产 物为绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下激发后发绿色荧光，可以方便观察阳性转化浮萍株。
[0015] 3、本发明采用浮萍叶状体直接作为转化受体，不必经过愈伤组织，该方法操作方 便，转化效率高，大大简化了将外源基因转化到宿主植株浮萍的操作，转化阳性率大大提 尚；
[0016] 3、本发明选用浮萍作为表达宿主植株，其结构简单，增殖快，遗传稳定；可用来生 产在细菌和酵母中不易表达的复杂蛋白质；严格的无菌培养使其不易受病毒的感染，其表 达的疫苗安全性高；相对于其他植物来说不需要田地来进行种植生长，可通过采用野外有 营养的废水来低廉生产有价值的融合蛋白或肽，而且还能净化废水供再利用；浮萍可在发 酵罐或生物反应器中生长，使其更容易整合入现存的蛋白质生产工业基础建设中因此采用 浮萍作为植物生物反应器系统来生产重组蛋白优越性是十分显著的。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明双元质粒基因转化农杆菌感受态细胞过程的提取质粒电泳图；
[0018] Ml--DL2000 DNA Marker ； 1--pcambia-1300-GFP 双元质粒；M2--λ /Hind III DNA marker〇
[0019] 图2为本发明双元质粒基因转化农杆菌感受态细胞阳性克隆鉴定图。
[0020] Ml--DL2000 DNA Marker ；1--GFP forward-GFP reverse 引物扩增后 的 pcambia-1300-GFP 双元质粒产物；2, 3--GFP forward-GFP reverse 引物扩增 pcambia-1300-GFP双元质粒转化农杆菌后的克隆产物。
[0021] 图3为本发明浮萍叶状体在含有不同浓度潮霉素，6-苄基嘌呤和萘乙酸培养基中 生长4周后再生情况。
[0022] 图4A、4B为本发明含有pcambia-1300-GFP双元质粒载体的浮萍植株中绿色荧光 蛋白的表达图。
【具体实施方式】
[0023] 下面，将结合具体实施例对本发明作详细说明。
[0024] 现有技术中引入外源基因的方法大多集中在选用愈伤组织作为转化对象，增加了 实验的难度和培养周期。本发明提供一种利用浮萍表达外源基因的方法。其中，本发明所 选用的外源基因载体为pcambia-1300-GFP双元质粒；该双元载体上已经整合有报告基因 GFP，并带有多克隆位点，方便外源基因的插入。转化的对象为农杆菌EHA105。该农杆菌 EHA105含有辅助Ti质粒，具有转化效率高的特点。
[0025] 本发明中采用了多种培养基，具体组分如下：
[0026] (I)YEB液体培养基：是用作农杆菌培养基。本发明根据分子克隆加以修改，即将 下列组分溶解在0. 9L水中：胰蛋白胨5g，酵母提取物lg，营养肉汤5g，蔗糖5g，MgS04 ·7Η20 0. 5g，各组分溶解后用lmol/L NaOH调整pH至7. 2,再补足水至1L，高压灭菌。
[0027] YEB固体培养基，是在YEB液体培养基的基础上添加琼脂粉15_20g/L。
[0028] (2) 1/2MS固体培养基：每升水中溶解有0. 825g/L的NH4N03、0. 95g/L的ΚΝ03、 0.085g/L 的 KH2P04、0.185g/L 的 MgS04.7H20、0.220g/L 的 CaCl2.2H20、0.83mg/L 的 KI、6.2mg/L 的 H3B03、22.3mg/L 的 MnS04.4H20、8.6mg/L 的 ZnS04,7H20、0.25mg/L 的 Na2MoO4 ·2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 ·5Η20、0· 025π^/1 的 CoCl2 ·6Η20、27. 8mg/L 的 FeSO4 ·7Η20、 37. 3mg/L 的 EDTA-Na2 · 2Η20、2· Omg/L 甘氨酸、0· lmg/L 盐酸硫胺素（VBl)、0· 5mg/L 盐酸吡 哆醇（VB6)、0· 5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、0· 4 %琼脂，0· 2 %植物凝胶。
[0029] (3)共培养基：含3%蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮、0· 5mg/L 6-苄基嘌呤的1/2MS固 体培养基。
[0030] 具体包括如下步骤：
[0031] 步骤一：将双元载体质粒转化至农杆菌中，得到重组农杆菌；然后配制形成农杆 菌悬液。
[0032] (1)将双元载体质粒转化至农杆菌中。根据分子克隆手册，制作农杆菌感受态细 胞，然后将50~IOOng pcambia-1300-GFP双元质粒加入100 μ 1所述农杆菌感受态中，混 勾成菌悬液，冰上放置30min ;放于液氮或-70°C预冷的工业酒精中速冻3~5min，再放于 28°C水浴5min。然后在所述菌悬液中进一步加入YEB液体培养基800 μ 1，在28°C下，150~ 180rpm振荡培养3~5h ;4000rpm离心2~4min。最后，弃去800 μ 1上清液，剩余的悬浮 菌体涂于含l〇mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上，26~30°C培养1-2天 直到形成单菌落，获得重组农杆菌。