一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用,属于基因 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 土曲霉是一种重要的丝状真菌,能够产生多种有价值的化合物,包括有机酸、酶 类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产, 具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展,通过代谢工程对生产菌株进行改造,提高目 标产物的生产水平,具有非常重要的意义。
[0003] 基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研宄手段,通常是指含已知序列的 DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组,整合至细胞受体基因组中,在特异性靶位点上增 加外源DNA片段,或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定 点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此,基因打靶技术在功能基因组 学以及菌株的基因工程改造研宄中发挥着至关重要的作用。随着大量组学数据的不断公 布,功能基因组学研宄以及基因工程改造往往涉及到多基因、多位点,而且还会用到多种研 宄策略。因此一种高效的遗传操作平台将可以为土曲霉功能基因组学研宄以及菌株基因工 程改造提供很大的便利。
[0004] 在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径(Non-homologous End Joining,NHEJ),从而导致外源DNA主要以随机插入方式整合到基因组上,同源重组效 率低下,使得基因打靶技术的应用受到了严重制约。
[0005] 筛选标签是遗传操作过程中所需要的一种重要元件,外源DNA需要与筛选标签一 起整合到基因组上,然后再通过筛选标签的表型被筛选出来。而在土曲霉中可用的筛选标 签非常少,无法满足对多基因、多位点进行遗传改造的需求。位点特异性重组系统是一种重 要的分子遗传操作工具,在多种原核生物和真核生物中都成功应用于筛选标签的切除。其 原理是重组酶识别并结合到具有特殊DNA序列的靶位点上,催化重组反应,使得位于靶位 点之间的DNA片段被剔除。常用的位点特异性重组系统有Cre/loxP系统、β -rec/six系 统和Flp/FRT系统,但在传统应用过程中需要以穿梭质粒形式或基因组整合形式向细胞中 导入重组酶表达元件,通过在细胞内表达出重组酶作用于识别位点对筛选标签进行切除。 pyrG(乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因)是一种与尿嘧啶营养缺陷型菌株搭配使用的营养选择 型标签,基于PryG作为筛选标签的转化系统具有双向筛选功能的特征,筛选标签存在与否 都可以通过相应的筛选培养基进行筛选。因此搭配位点特异性重组系统使用,会使得筛选 标签的剔除更加尚效、易行。
【发明内容】
[0006] 为解决土曲霉菌种的同源重组能力低,筛选标签数量少导致基因打靶技术在土曲 霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题,本发明提供了一种用于提高基因打靶技术在 土曲霉中应用效率的方法,所采取的技术方案如下:
[0007] 本发明的目的在于提供一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法, 该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌,先通过敲除ku80基因或lig4基因提 高外源DNA的同源重组概率,再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛 选标签的遗传转化系统,最后以直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组 系统切除两侧带有同向IoxP序列的筛选标签,使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征,能 再次用于基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化,以该方式实现筛选标签的循环利用。
[0008] 所述方法的步骤如下:
[0009] 1)以土曲霉为出发菌,通过敲除ku80基因或lig4基因,构建外源DNA同源重组概 率提高的重组菌;
[0010] 2)在步骤1)所得重组菌的基础上敲除PyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株, 再以所得的尿喃啶营养缺陷型菌株为受体菌,以两端带有IoxP位点的PyrG基因表达元件 (loxP-pyrGl-loxP)作为筛选标记进行回补实验验证,建立基于pyrG筛选标记和尿喃啶营 养缺陷菌株的遗传转化系统,同时获得整合有ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌;
[0011] 3)利用步骤2)所得的整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌,结合改良的位 点特异性重组系统切除筛选标记,获得的ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签被切除的尿嘧啶营养 缺陷型重组菌,在该重组菌中ΙοχΡ-pyrGl-loxP可以再次作为筛选标签进行再次的基因工 程改造。该方式使得ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签可以多次、重复被应用于菌株的基因工程 改造,从而使遗传改造工作不受筛选标签数量所限制。
[0012] 所述方法的步骤如下:
[0013] 1)以土曲霉CICC 40205为出发菌,敲除ku80基因(或lig4基因),构建外源DNA 同源重组概率提高的重组菌At- Δ ku80 (或At- Δ lig4);
[0014] 2)构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-K0,敲除步骤1)所得重组菌At-Aku80的pyrG 基因,获得PyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At- Λ ku80- Λ pyrG ;
[0015] 3)以曲霉的pyrG基因的表达框元件pyrGl为筛选标签构建以ku80基因上下游序 列作为同源臂的打靶元件ku80-pyrGl-gfp,将打靶元件ku80-pyrGl-gfp转化入步骤2)所 得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-AkuSO-ApyrG中进行回补实验验证,经过培养筛选以及 验证后,获得基于尿喃啶营养缺陷型重组菌At-Δ ku80-Δ pyrG和pyrGl的遗传转化系统, 获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标记的的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP ;
[0016] 4)制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl_loxP的原生质体,向所得的原生质 体内导入Cre重组酶切除筛选标签pyrGl,通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrGl 筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At- Δ ku80_ Δ pyrGl-loxP。
[0017] 重组菌 At-Δ ku8〇-ApyrGl-IoxP 恢复了步骤 2)所获得重组菌 At-Δ ku8〇-Δ pyrG 的尿嘧啶营养缺陷的特征,可再次作为受体菌用于基于pyrGl筛选标签的遗传转化。
[0018] 优选地,步骤1)所述敲除ku80基因,是通过PCR扩增出基因 ku80的上游序列 U-ku80和下游序列D-ku80,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段,通过融合PCR技术将ptrA 片段分别与上游U-ku80和下游序列D-ku80进行融合,再以融合产物为模板通过PCR分别 扩增出打祀元件ku80_A和打祀元件ku80_B,再将打祀元件ku80_A和打祀元件ku80_B转化 到制备好的土曲霉原生质体中培养,最后筛选敲除ku80基因的转化子。
[0019] 优选地,步骤1)所述敲除lig4基因,是通过PCR扩增出基因 lig4的上游序列 U-lig4和下游序列D-lig4,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段,通过融合PCR技术将ptrA 片段分别与上游U-lig4和下游序列D-lig4进行融合,再以融合产物为模板通过PCR分别 扩增出打祀元件lig4_A和打祀元件Iig4-B,再将打祀元件Iig4-A和打祀元件Iig4-B转化 到制备好的土曲霉原生质体中培养,最后筛选敲除lig4基因的转化子。
[0020] 优选地,步骤2)所述构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO,是以土曲霉的基因组为 模板,设计引物通过PCR分别扩增出pyrG基因的上游序列U-pryG和下游序列D-pyrG,通过 融合PCR将U-pryG和D-pyrG进行融合,再以融合片段为模板,通过巢式PCR扩增出pyrG 基因的打革El元件PyrG-KO ;
[0021] 优选地,步骤3)所述构建打革El元件ku80-pyrGl_gfp,是人工合成带有两个同向 IoxP序列位点的DNA片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,再将该DNA片段克隆到载体 pUC57simple上,获得载体PalcA-syn ;以黑曲霉C〇827基因组为模板,设计引物通过PCR扩 增获得黑曲霉pyrG基因的表达元件,作为筛选标签pyrGl,将筛选标签pyrGl克隆到载体 PalcA-syn上的两个同向IoxP位点之间,获得质粒pXH103 ;再以pSGF957为模板,设计引物 进行PCR扩增gfp-TtrpC片段,再将gfp-TtrpC表达元件连接到质粒pXH103上,获得质粒 PXH104;再以土曲霉基因组为模板,设计引物通过PCR分别扩增ku80基因的下游和上游同 源臂,并先后克隆到质粒PXH104上,获得质粒pXH106,再以质粒pXH106为模板,通过PCR扩 增获得打祀元件ku80-pyrGl-gfp ;
[0022] 优选地,步骤4)所述导入Cre重组酶切除筛选标签pyrGl,是向已制备好的 100 μ L重组菌At- Δ ku8〇-pyrGl-loxP的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1 μ g pyrGl 片段和10 μ L 40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min,加入1ml STC溶液后于30°C下孵育 30min,孵育结束后与含有I. 2M山梨醇,4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混 合后倾注于含有I. 2M山梨醇,lg/L 5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基 平板上,在30°C、黑暗条件下培养6-10天,培养结束后挑取转化子传代纯化3-5次,筛选验 证后获得筛选标签pyrGl被切除的尿喃啶营养缺陷重组菌At- Δ ku80- Δ pyrGl-loxP,该重 组菌在CD平板上无法生长,可再次作为受体菌用于基于pyrGl筛选标签的遗传转化。
[0023] 优选地,所述方法的具体步骤如下:
[0024] 1)以土曲霉CICC 40205为出发菌,以质粒pPTR II为模板,以SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段;以土曲霉CICC40205的基因组 为模板,以SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列为引物,通过PCR扩增出上游序列 U-ku80;以土曲霉CICC40205的基因组为模板,以SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 7所示核苷酸序 列为引物,通过PCR扩增出上游序列D-ku80 ;通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80进行融合,再以融合产物为模板,以如SEQ ID NO. 8-SEQ ID NO. 9所示核 苷酸序列为引物,通过PCR扩增出打靶元件ku80-A,再以如SEQ ID NO. 10-SEQ ID NO. 11所 示核苷酸序列为引物,通过PCR扩增出打靶元件ku80-B ;再将打靶元件ku80-A和打靶元件 ku80-B转化到制备好的土曲霉原生质体中培养,最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得 敲除ku80基因的重组菌At-Δ ku80 ;
[0025] 2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板,以如SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 13所示 核苷酸序列为引物,扩增pyrG基因的上游序列U-pyrG ;再以土曲霉CICC40205的基因组为 模板,以如SEQ ID NO. 14-SEQ ID NO. 15所示核苷酸序列为引物,扩增pyrG基因的下游序 列D-pyrG ;再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG,以融合产物的序列为 模板,以如SEQ ID NO. 16-SEQ ID NO. 17所示核苷酸序列为引物,通过PCR扩增出pyrG基 因的打革G元件pyrG-KO,再制备步骤1)所得重组菌At-Aku80的原生质体,再将pyrG基因 的打革G元件pyrG-KO转化到原生质体内,经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿喃啶营养 缺陷型菌株At- Δ ku80_ Δ pyrG ;
[0026] 3)通过人工合成带有两个同向IoxP序列位点的DNA片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,再将该DNA片段克隆到载体PUC57simple上,获得载体PalcA-syn ;以黑曲霉 Co827基因组为模板,以如SEQ ID NO. 18-SEQ ID NO. 19所示核苷酸序列为引物,通过PCR 扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件,作为筛选标签pyrGl,再将筛选标签pyrGl克隆到载 体PalcA-syn上,获得质粒pXH103,获得如SEQ ID NO. 26所示的两侧带有同向IoxP位点 序列的 PyrGl 筛选标签 loxP-pyrG-loxP ;再以 pSGF957 为模板,以如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID NO. 21所示核苷酸序列为引物,通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC片段,再将gfp-TtrpC 片段连接到质粒PXH103上,获得质粒pXH104 ;再以土曲霉CICC40205基因组为模板,以如 SEQ ID NO. 22-SEQ ID NO. 23所示核苷酸序列为引物,通过PCR扩增出ku80基因下游同源 臂片段,再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上,获得质粒pXH105 ; 再以土曲霉CICC40205基因组为模板,以如SEQ ID NO. 24-SEQ ID NO. 25所示核苷酸序 列为引物,通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段,再将扩增的出ku80基因上游同源 臂片段连接到质粒PXH105上,获得质粒pXH106 ;最后再以质粒pXH106为模板,以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80-pyrGl-gfp ;再将