聚乙二醇(peg)化小分子量pei衍生物、制备方法、用途及其复合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种聚乙二醇（PEG)化PEI衍生物、制备方 法、用途及其复合物。
【背景技术】
[0002] 基因治疗，是将外源性基因物质（DNA或RNA)导入细胞，促成或者抑制特定蛋白的 表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。在体内DNA、RNA可被DNA 酶、RNA酶迅速降解通过肾脏排出；并且DNA、RNA分子量大，带有负电荷，裸DNA、RNA不能穿 过细胞膜进入细胞内。因此基因疗法应用于人体的关键在于寻找安全有效的基因载体。
[0003] 常用的基因输送载体可以分为重组病毒载体及非病毒载体。在临床应用中，病毒 载体的安全性问题一直备受质疑；非病毒载体在安全性上优于病毒载体。与病毒载体相比， 非病毒载体有其特有的优势：易于合成、可以运载大量基因、免疫反应弱等优势。
[0004] 研宄者选用不同非病毒载体运载质粒，例如：PLGA、PLL、PAGA等。但这些材料在基 因输送方面存在一定的局限性。目前，研宄较多的非病毒载体材料为聚乙烯亚胺（PEI)。
[0005] PEI分子包括伯胺、叔胺、季胺，通过质子海绵效应与DNA及RNA结合。不同类型的 PEI (分支、线性），不同分子量PEI(25KDa、10KDa、800Da)体内及体外均以被研宄。研宄表 明：PEI衍生物的毒性与相对分子量息息相关，相对分子量越大，转染效率越尚但细胞毒性 也越大。因此，迫切需要在降低载体的毒性的基础上能够提高其转染效率的新型载体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种PEG化的PEI衍生物、制备 方法、用途及其复合物。本发明制备的PEG化的PEI衍生物具有高的转染活性和较小的细 胞毒性，在不同的细胞中均具有较好的生物活性，是高效、低毒的基因物质载体，用于输送 基因物质。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明的第一方面提供了一种PEG化的PEI衍生物，其结构式为：
[0009]
[0010] 优选的，所述PEG化的PEI衍生物的基本构建单元为小分子量PEI，所述小分子量 PEI的分子量为800Da。
[0011] 本发明的第二方面提供一种制备前述PEG化的PEI衍生物的方法，具体包括以下 步骤：
[0012] (a)将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-Sc)与PEI-Et按比例加入碳酸 氢钠水溶液中；
[0013] (b)搅拌、摇动或震荡步骤（a)所得反应体系，使之发生缩合反应，即得PEG化的 PEI衍生物。
[0014] 优选的，步骤（a)中，单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-Sc)与PEI-Et 的摩尔比为1:2~2:1，更优选为1:1。
[0015] 优选的，步骤（a)中，碳酸氢钠水溶液的浓度为0· 1~1M，更优选为0· 1M。
[0016] 优选的，步骤（a)中，所述PEI-Et是指氨酯键小分子量PEI交联衍生物，其结构式 为：
[0017]
[0018] X 为 1 ~20, y 为 1 ~20。
[0019] 所述PEI-Et为现有技术，所述PEI-Et已经在申请日为2011年10月25日提交的 申请号为ZL201110327129. X的专利申请中请求保护。所述PEI-Et的具体制备方法为：将 小分子量PEI与乙二醇二氯甲酸酯按摩尔比为3:2的比例加入三乙胺-氯仿体系中；搅拌、 摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述小分子量PEI交联衍生物。
[0020] 优选的，所述方法还包括分离纯化的步骤：将所述PEG化的PEI衍生物用超纯水溶 解后，置于透析袋中透析；透析结束后，用微孔滤膜过滤，冻干。
[0021] 优选的，所述透析袋的截留分子量为3500Da。
[0022] 优选的，所述透析时采用的透析液选自超纯水、纯净水中的任意一种。
[0023] 优选的，所述透析的时间24~48小时。更优选为48小时。
[0024] 优选的，所述微孔滤膜的孔径为0. 22~0. 45 μ m。更优选为0. 45 μ m。
[0025] 本发明的第三方面还提供了一种上述的PEG化的PEI衍生物在制备用于输送基因 物质载体中的用途。
[0026] 本发明的第四方面提供了 一种复合物，所述复合物包括上述PEG化的PEI衍生物。
[0027] 优选的，所述复合物包括上述PEG化的PEI衍生物和质粒。
[0028] 优选的，所述复合物中，上述PEG化的PEI衍生物和质粒的质量比为1:1~50:1。
[0029] 优选的，所述质粒选自DNA质粒、荧光酶蛋白质粒或GFP质粒中的任意一种。
[0030] 本发明的第五方面提供了前述复合的制备方法：将上述PEG化的PEI衍生物溶液 加入到质粒溶液中，混合均匀，孵育，即得。
[0031] 优选的，所述孵育具体为室温下，孵育30~60min。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0033] (1)本发明制备的含有PEG化的PEI衍生物结构简单、易于合成；
[0034] (2)本发明制备的含有PEG化的PEI衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性， 与现有的PEI-Et相比，表面电荷密度低。
[0035] (3)本发明制备的含有聚乙二醇结构的可降解PEI衍生物在不同的细胞株中均表 现出较高的转染活性（与PEI 25KDa相比），同时比PEI-Et有更低的细胞毒性。
【附图说明】
[0036] 图1为PEG化的PEI衍生物的制备方法的合成路线示意图；
[0037] 图2为PEG化的PEI衍生物的核磁共振图谱；
[0038] 图3为实施例2中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的粒径图；
[0039] 图4为实施例2中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的电势图；
[0040] 图5为实施例2中PEG-Et 1:1与DNA质粒质量比为10时合成的复合物的透射电 子显微镜图；
[0041] 图6为实施例3中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的MCF-7细胞 转染活性示意图；
[0042] 图7为实施例3中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的CT-26细胞 转染活性示意图；
[0043] 图8为实施例3中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的HeLa细胞转 染活性示意图；
[0044] 图9为实施例4中不用浓度PEG-Et 1:1与PEI-Et、PEI 25KDa的MCF-7细胞毒性 比较示意图；
[0045] 图10为实施例4中不同浓度PEG-Et 1:1与PEI-Et、PEI 25KDa的CT-26细胞毒 性比较示意图；
[0046] 图11为实施例4中不同浓度PEG-Et 1:1与PEI-EtJEI 25KDa的HeLa细胞毒性 比较示意图；
[0047] 图12为实施例5中不同比例PEG-Et与质粒质量比不同时合成的复合物的MCF-7 细胞转染活性示意图；
[0048] 图13为实施例5中不同比例PEG-Et与质粒质量比不同时合成的复合物的CT-26 细胞转染活性示意图；
[0049] 图14为实施例5中不同比例PEG-Et与质粒质量比不同时合成的复合物的HeLa 细胞转染活性示意图；
[0050] 图15为实施例6中不同比例、不用浓度PEG-Et在MCF-7细胞毒性比较示意图；
[0051] 图16为实施例6中不同比例、不同浓度PEG-Et在CT-26细胞毒性比较示意图；
[0052] 图17为实施例6中不同比例、不同浓度PEG-Et在HeLa细胞毒性比较示意图。
【具体实施方式】
[0053] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0054]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与