细胞及器官体外3-d培养装置及人工器官培育的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物学技术领域，涉及一种细胞及器官体外3-D培养装置及人工器官的培育方法。
【背景技术】
[0002]为避免细胞或组织在二维(2-D)生长过程中逐渐失去许多原组织生理特征的弊端，人们发明了体外三维(3-D)培养。目前采用的体外3-D培养装置主要采用生物反应器(B1reactor，BR)，是指利用酶或生物体(如微生物)所具有的生物功能在体外提供生物活性环境的装置系统或工程设备。根据培养细胞、培养载体、培养液混合方式的不同BR主要分为搅拌式、气体式、中空纤维式、回旋式(空间BR)等。根据结构的不同BR分为旋转技术结合普通37°C 5% C02细胞培养箱的箱体结构；循环培养装置和普通37°C 5%C02细胞培养箱的箱体结构、循环培养装置和普通37°C 5% C02细胞培养箱各自独立装置和循环培养结合气体交换密闭式装置。此外，与BR配套的辅助技术还有灌注培养式、微载体式、多孔微球式等。
[0003]然而，从经济效益考虑，这些BR普遍存在成本高、设备复杂等。例如从功能角度搅拌式BR的搅拌桨叶产生的剪切力可对细胞造成损伤；中空纤维式BR的培养环境不均一、培养工艺不易放大、消毒重复使用困难等；从结构角度分析，结构一装置造价昂贵，体积庞大，无疑增加了对仪器购买及使用的难度；结构二装置除造价昂贵，体积庞大外，装置中3-D培养管是固定存在培养箱中的，不能进行旋转，无法很好实现细胞或组织类似于人体发育过程这样一个自然悬空运动生长的立体培养功能，导致人工器官功能缺失或发育不良；结构三装置中虽然摇摆或旋转系统可使细胞3-D培养在动态过程中，但由于3-D培养管置于培养箱外，大大增加了污染机率，循环培养结合气体交换密闭式装置则要求造价较高的高级别周围培养氛围。
[0004]为克服上述问题，急需对现有的培养装置进行结构改进，改进的装置既可模拟胎儿在母体胎盘羊水发育过程中的复合运动，又可进行代谢物质的循环交换，既可充分满足细胞高密度增值需要，又可保证细胞高效分泌，为细胞或器官体外培育提供一个简单、经济、温和、立体、营养全面的3-D生长微环境，促进细胞再生和人工器官的生成。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种细胞及器官体外3-D培养装置，以解决现有技术无法真实模拟人体器官生长微环境导致人工器官存在发育不良、功能缺失、培育效率低的问题。本发明的目的之二提供采用上述细胞及器官体外3-D培养装置进行人工培育器官的方法。
[0006]本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明的细胞及器官体外3-D培养装置，包括培养室、可做复合运动的3-D运动摇箱，以及分别与培养室连通的条件培养液循环系统和气体交换系统，所述培养室通过弹性部件可拆卸的悬挂于3-D运动摇箱内，还包括设置在3-D运动摇箱一侧或两侧的多自由度运动机构。
[0008]进一步，所述培养室的培养环境:温度为37°C ;湿度为95?98% ;含体积分数为5%0)2的空气；酸碱P H值为7.2-7.4。
[0009]进一步，所述多自由度运动机构包括纵向旋转机构、水平旋转机构和设置在两者之间的多功能连接结构，所述条件培养液循环系统及气体交换系统通过多功能连接结构与外界连接进行培养液及气体交换。
[0010]进一步，所述纵向旋转机构包括纵向旋转轴和调速电机I，所述纵向旋转轴的一端与3-D运动摇箱固定，另一端与调速电机I的主轴固定。
[0011]进一步，所述水平旋转机构包括水平旋转架、水平旋转轴和调速电机II，所述水平旋转架的一端与纵向旋转轴的一端转动连接，另一端与水平旋转轴的一端转动连接，所述水平旋转轴的另一端与调速电机II的主轴固定。
[0012]进一步，所述水平旋转架与纵向及水平旋转轴的连接处均设置有多功能连接结构。
[0013]进一步，所述多自由度运动机构设置在3-D运动摇箱的两侧，所述多自由度运动机构还包括固定设置在3-D运动摇箱另一侧的纵向从动轴，所述纵向从动轴与水平旋转架之间设置有多功能连接结构。
[0014]进一步，所述多功能连接结构包括可转动且密封套装于纵向或水平旋转轴外圆面的活动套、设置在活动套与纵向或水平旋转轴之间的密封腔、设置在活动套与纵向或水平旋转轴之间的滚动轴承，以及设置在水平旋转轴、水平旋转架、纵向旋转轴和纵向从动轴内的条件培养液循环通道和气体交换通道，所述密封腔通过条件培养液循环通道及气体交换通道分别与培养室连通。
[0015]进一步，所述培养室内均匀间隔设置有多个弹性材料制成的挡板，所述挡板的头部设置具有圆弧顶部的弹性缓冲薄膜。
[0016]进一步，所述弹性部件为弹簧或橡胶或其它弹性件。
[0017]进一步，所述培养室包括室体和可将室体密封固定的室盖，所述室盖设置有与室体相互嵌合的卡合结构，所述室体设置有与卡合结构相匹配的卡合配合结构。
[0018]进一步，还包括用于对本培养装置进行全自动控制的PLC控制系统和信息显示系统。
[0019]本发明的目的之二是通过以下技术方案实现的:
[0020]采用如上所述体外细胞及器官3-D培养装置培育人工器官的方法，利用细胞及器官体外3-D培养装置模拟人体器官生长发育的动态环境培育人工器官。
[0021]进一步，所述人体器官生长发育的动态环境包括:将种子细胞的天然去细胞的整体器官支架弹性地悬挂于3-D培养装置内，在37°C、体积分数为5% CO2条件下分阶段培养，第一阶段I?7天，第二阶段8?14天，第三阶段15?21天，采用24h动态培养，白天先水平向左360°旋转，后水平向右360°旋转，晚上采用纵向旋转和水平旋转相结合的复合3-D旋转，白天转速为20?40rpm/min，晚上转速小于20rpm/min，每三天换培养基一次，每阶段更换不同的培养基。
[0022]本发明的有益效果:
[0023]1、本发明的的细胞及器官体外3-D培养装置，通过设置3-D运动摇箱模拟胎儿在母体胎盘羊水发育过程中的人体发育复合运动，并通过培养室弹性的设置在摇箱内模拟培养物在人体内悬吊过程中的简谐运动，较真实的模拟了人体细胞或器官在发育过程中的生长微环境，提高各种种子细胞的分化为成熟细胞密度及培养效率，为细胞或器官的体外3-D培养提供一个简单、经济、温和、立体、营养全面的生长微环境，加速体外人工器官生成，该装置与现有技术相比，具有明显的成本优势和推广价值。
[0024]2、通过多功能连接结构实现介质输入系统与转轴之间可相对转动的目的，再由于将各介质通道设置在转轴上，3-D运动摇箱与培养室实现生长环境所需介质(培养液及370C 5% CO2气体)与培养室连通和交换，解决了多自由度转动过程中输入管道缠绕的问题。
[0025]3、本发明培育人工器官的方法，由于该装置真实模拟人体细胞或器官的生长发育微环境，可以实现对各种人体器官的体外培育和重建。利用本发明的方法培养形成的肝脏样组织仅需3周时间，比近期报道采用BR方法体外诱导DLS间充质干细胞(Meschymal stemcells, MSC)形成的肝样组织(需要4周时间)节省I周时间，实验表明本发明制得的人工肝脏具有肝脏结构和功能，能够作为肝移植供体使用，进一步证实采用本装置进行人体器官体外培育的方法是可行的，可以进行临床推广应用，且具有广阔的应用前景和较高的社会价值。
[0026]本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研宄对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
【附图说明】
[0027]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:
[0028]附图1为本发明的体外细胞及器官3-D培养装置的结构示意图；
[0029]附图2为本发明培养室的放大图；
[0030]附图3为本发明多功能连接结构I的放大图；
[0031]附图4为本发明多功能连接结构II的放大图；
[0032]附图5为本发明多功能连接结构III的放大图。
[0033]附图6为用本装置培育的人工肝脏。A为体外3-D培养第9天生成肝叶样结构；B体外3-D培养第21天生成类全肝样结构；C(a_b)组织切片显示有与正常肝脏相似的肝小叶样结构；C(c)分泌肝功能蛋白。
[0034]附图7为为哺乳类动物肝脏发育成熟示意图。A为小鼠；B为人类。
[0035]附图标记:1_培养室；2-3_D运动摇箱；3_纵向旋转轴；4_调速电机I ;5_水平旋转架；6_水平旋转轴；7_调速电机II ；8-纵向从动轴；9_活动套