一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株酿酒酵母及其在发酵山楂酒中的应用，属于工业微生物领域。
【背景技术】
[0002] 山楂是我国特有的水果，属于蔷薇科山楂属植物，其野生品种广泛的分布于世界 各地，但在我国早在唐代就以作为栽培水果加以利用。山楂具有重要的药用保健价值，自古 以来，人们将它视为消食化滞、活血化痰、健脾开胃的良药。山楂中的维生素含量丰富，维生 素 C、维生素 E以及胡萝卜素的含量均在水果中名列前茅。除维生素外，山楂还含有丰富的 有机酸、黄酮类物质、单宁类物质以及矿物质，这些成分都对人们的身体健康有着积极的影 响，可以起到提高机体免疫力、强健体魄的作用。据报道，山楂富含的抗氧化剂成分可以起 到防老化、起到美容、防癌和防治动脉硬化的功效，黄酮类物质有利于稳定、调节血压、降低 胆固醇，山楂中丰富的膳食纤维和果胶成分，可以促进肠道的螺动和消化腺的分泌，有助于 食物的消化和废物排泄。果胶具有降低胆固醇和血糖、预防胆结石的功效。
[0003] 目前我国市场上较多的加工产品有山楂片、山楂糕、蜜饯山楂脯、果丹皮、山楂酱、 山楂饼、山楂耀头、山楂酒、山楂汁、山楂饴等，而山楂酒种类少，品质差。其中市售的山楂酒 一般多为调制酒，其制作工艺依然停留在浸泡工艺或是模仿葡萄酒加工工艺，口感上多以 苦湿为主，很难获得消费者青睐，一些所谓的高黄酮山楂酒是在山楂汁中加入了部分山楂 叶黄酮而得到，均为非发酵酒。山楂饮品多釆用调配工艺，产品定位属于低成本快消品范 畴，很少注重产品的营养成分保护和风味特征。现有的少数发酵山楂酒多采用山楂清汁发 酵，其营养物质损失较大，口感风味较差。
[0004] 酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。是子囊菌、担子菌等几科单细 胞真菌的通称，可用于酿造生产。酵母是酿造山楂酒的关键因素之一，是影响山楂酒口感和 风味的重要因素，决定着果酒品质的优劣。我国果酒酿造中使用的酵母大部分来源于商业 活性干酵母，其品质单一，通用适用性强，但对于个别特殊条件适应力差，活性干酵母在生 产上多经好氧培养，因此其厌氧发酵性能、低温发酵性能，耐低PH及耐乙醇性能等较差。而 山楂酒山楂汁的酸度较高，pH较低，商业活性干酵母及部分酵母菌在此条件下难以生长，导 致酒精产量低，因此有必要对酵母菌进行筛选，从而筛出一株低PH条件下仍可以正常生长 并高产酒精的酵母菌。
[0005] 山楂酒口感较酸，原因是山楂酒中含有较多有机酸，其中主要有机酸为柠檬酸，柠 檬酸是三元酸，酸性较强。目前传统的降酸方法有化学降酸法，通过添加 CaC03、K2C03、KHC03 降低酸度；物理降酸法：壳聚糖吸附降酸法、明胶吸附降酸法等。但这两种方法易导致酒体 浑浊，同时破坏酒体口感，导致酒的品质降低。本发明筛选出的酵母菌通过实验发现具有显 著的降柠檬酸能力，这种降酸过程在发酵中自然发生，不添加新物质，不会导致酒体浑浊、 口感降低。而且通过降低酸度改善了山楂酒的口感，提升了品质。
【发明内容】
[0006] 本
【发明内容】
的目的是提供一株适用于发酵山楂酒的特色酵母菌株，用于酿造发酵 山楂酒。
[0007] 本发明一方面提供了一种酿酒酵母Y2 (Saccharomyces cerevisiae Y2)，该株酵 母菌具有较强的低PH耐受能力，使用该株酿酒酵母制得的发酵山楂酒乙醇产量高，副产物 甘油少，降低柠檬酸效果好，发酵较为完全，残糖含量低，且酒精比产率高，最终制得的山 楂酒风味良好。所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) Y2,于2015年3月15日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015119。
[0008] 本发明还提供了应用上述酿酒酵母酿制发酵山楂酒的方法，是以山楂果浆为底物 进行发酵。具体包括以下步骤：
[0009] 1.按1:3~1:4的料水比将山楂打浆；
[0010] 2.加入果胶酶在50°C条件下处理3~4h，果胶酶添加量150ppm ;
[0011] 3.加入200g/L葡萄糖、0. 4g/L磷酸氢二铵、0. 2g/L亚硫酸钠，与山楂果浆混合均 匀；
[0012] 4.接入酵母菌Y2种子培养液，接种量15%~20% ;
[0013] 5.置于厌氧环境下进行发酵，
[0014] 6.发酵结束后离心灌装灭菌。
[0015] 本发明的酿酒酵母在pH2. 7-2. 9的低pH条件下产酒精能力强，乙醇产量比其余实 验酵母所酿山楂酒多15g/L以上，同时降柠檬酸效果显著，柠檬酸从19g/L降至3g/L，副产 物甘油少，发酵效果比普通商业活性干酵母好，风味口感好。
[0016] 生物材料保藏
[0017] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) Y2,于2015年3月15日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015119。
【附图说明】
[0018] 图1.二级种子生长曲线
[0019] 图2.发酵培养基中酵母菌生长曲线
[0020] 图3.乙醇产量趋势图
[0021] 图4.甘油产量趋势图
[0022] 图5.山楂酒柠檬酸含量变化趋势图
[0023] 图6.残糖含量变化趋势图
[0024] 图7.不同酵母酿造山楂酒比产率
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中各培养基的配方如下：
[0026] Yro培养基（一级种子培养基）：酵母提取物20g/1000mL，蛋白胨20g/1000mL，葡 萄糖20g/1000mL，自然pH值，115°C、20min高压灭菌。固体培养基中加入17g/1000mL琼脂 粉。
[0027] 二级种子培养基：山楂浓缩汁调整终糖浓度50g/L，加入0. 4g/L磷酸氢二铵， 0. 2g/L亚硫酸钠，调节pH2. 7-2. 9。
[0028] 发酵培养基：山楂浓缩汁调整终糖浓度200g/L，加入0. 4g/L磷酸氢二铵，0. 2g/L 亚硫酸钠。按体积比10-20%接种二级种子培养液，于20-25°C下发酵6-15天。
[0029] 山楂购自山东省枣庄市山亭区水泉镇，品种为五棱山楂。山楂浓缩汁的制备：按 1:4的料水比将山楂打浆，加入果胶酶在50°C条件下处理3h，果胶酶添加量150ppm。
[0030] 对山楂酒样品进行高效液相色谱分析：
[0031] A预处理
[0032] (1)将取样的ImL菌液放入L 5mL离心管中离心去除菌体，离心条件12000rpm， Imin0
[0033] (2)取上清液0. 75mL移入EP管中，加入0. 75mL的10%三氯乙酸溶液，振荡混匀， 放入4°C冰箱静置5h。
[0034] (3)静置完毕后进行离心，离心条件12000rpm，20min，取上清液ImL过0. 22 μπι水 系膜移入液相进样瓶中备用。
[0035] B液相色谱分析
[0036] 使用Shodex SClOll折射率检测柱（昭和电工有限公司，东京，日本）分析测定葡 萄糖、果糖、乙醇、甘油和柠檬酸。在50°C，流动相为0.0 lmol/L的稀H2SO4溶液，在50°C条 件下以lmL/min的流速进样。
[0037] 实施例1酵母菌的分离纯化
[0038] 1.出发菌株的选育
[0039] (1)自然发酵分离酵母菌
[0040] 无菌称量50g成熟山楂，用无菌研钵研碎后放入500mL锥形瓶中，加入150mL无菌 水，纱布封口，置于恒温摇床进行培养，培养条件30°C、150rpm。
[0041] 每隔24h取发酵液lmL，加入9mL无菌水中进行梯度稀释至1(T，取50 μ 1稀释后 菌液放入YPD固体培养基涂布，放入30 °C培养箱中培养48h。
[0042] (2)纯化培养
[0043] 对培养箱中已培养48h的酵母菌株，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落， 分别移入YPD固体平板培养基上，30°C恒温培养、纯化直至得到单菌落后，转接至斜面试管 作为出发菌株，得到65株菌。
[0044] 2.酵母菌株初筛
[0045] (1)镜检初筛：挑取斜面试管中的菌株接种于YH)液体培养基中置于恒温摇床培 养48h，培养条件30°C，150rpm。以16X40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株， 得到26株菌。
[0046] (2) WL营养琼脂培养基筛选：将镜检筛选出的菌株，接种YH)液体培养基活化24h 后接种到WL营养琼脂培养基，30°C培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（乳白色），球 形突起的表面光滑、不透明、奶油状的菌株，得到7株菌。另取2株商业活性干酵母作为实 验对照菌株。
[0047] 3.酵母菌保藏
[0048] 取Yro液体培养基中底部大量菌悬液ImL于2mL甘油保藏管中，加入ImL 30 %的 甘油，放置于-80超低温冰箱中保藏，结果如下表1所示。
[0049] 表1
[0050]
[0051] 实施例2酵母菌二级种子生长曲线
[0052] 1.取已培养20h的酵母种2. 5mL于50mL二级种子培养基中，接种量5%，每组做 两个平行。
[0053] 2.用纱布封口，置于恒温摇床进