一株蒙氏肠球菌及其在低温青贮中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株蒙氏肠球菌及其在低温青贮中的应用。
【背景技术】
[0002] 青贮是在乳酸菌的厌氧发酵作用下将碳水化合物转化为有机酸，从而使pH降低 达到长期贮存的目的。乳酸菌和温度是青贮饲料发酵品质好坏的决定性因素。
[0003] 燕麦是高寒地区冬春饲补的主要饲料作物，由于高寒地区温度低海拔高，不利于 乳酸菌的生长，很难发酵出品质优良并可以长期贮存的饲料。
[0004] 因此，筛选出耐高低温、耐盐、耐酸碱的抗逆性较强的菌株，并将其作为发酵剂添 加到低温青贮燕麦饲料中，将会对高寒地区的青贮饲料制作有着巨大的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一株蒙氏肠球菌。
[0006] 本发明所提供的蒙氏肠球菌具体为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255,该菌株已于2015年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地 址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心），其保藏编号为 CCTCC NO :M 2015253。
[0007] 所述蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii)QHl_255从中国青海省尖扎县野生小麦 上分离得到，该菌株单菌落形状为圆形，革兰氏染色阴性，不产过氧化氢，不能利用葡萄糖 发酵产气，为同型发酵菌株。在50°C、6. 5% NaCl和pH值3到4的条件下生长微弱，其余测 定条件均生长良好，具有较好的耐高低温，耐碱以及耐盐的生长能力。其16S rDNA序列如 序列表中序列1所示。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种菌剂。
[0009] 本发明所提供的菌剂的活性成分为所述蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC NO :M 2015253。
[0010] 所述菌剂除了包含作为活性成的所述蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC N0:M 2015253外，还可包含辅料，如MRS固体培养基（溶剂为水，溶质及其 浓度如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐 温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L)。 [0011] 本发明的第三个目的是提供一种青贮饲料添加剂。
[0012] 本发明所提供的青IC饲料添加剂的活性成分为所述蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii)QH1-255CCTCC NO ：M 2015253〇
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种青贮饲料。
[0014] 本发明所提供的青贮饲料中含有所述青贮饲料添加剂。
[0015]所述蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii)QHl_255CCTCC NO :M 2015253或所述菌 剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0016] (al)抑制细菌；
[0017] (a2)制备细菌抑制剂；
[0018] (a3)制备所述青IC饲料添加剂；
[0019] (a4)制备所述青IC饲料。
[0020] 所述（al)的应用为非疾病诊断治疗性应用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述细菌具体可为藤黄微球菌和/或沙门氏菌。
[0022] 其中，所述蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii)QHl-255CCTCC NO :M 2015253 或 所述菌剂对所述细菌的抑制具体体现为30°C条件下的抑制。
[0023] 所述青贮饲料添加剂在制备所述青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明的第五个目的是提供一种制备所述青贮饲料的方法。
[0025] 本发明所提供的制备所述青贮饲料的方法，具体可包括：将青贮原料与所述蒙氏 肠球菌（Enterococcus mundtii)QHl_255CCTCC NO :M 2015253混合，进行固体厌氧发酵，收 集所有发酵产物，得到所述青贮饲料；
[0026] 在本发明中，所述青贮原料为燕麦全株；具体为乳熟期的燕麦全株，水分含量 82. 97%，切割成l-2cm小段。
[0027] 在所述方法中，所述燕麦全株和所述蒙氏肠球菌（^Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC NO :M 2015253的配比可为100g :105cfu ;所述发酵为低温发酵；所述低温可 为5°C ;所述发酵的时间可为30天。
[0028] 本发明所提供的蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC NO : M2015253具有耐高低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮（5°C)过程中迅速繁殖并产 酸降PH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保 留，非营养物质如粗灰分成分降低，达到长期保存青贮饲料的效果。
[0029] 保藏说明
[0030] 菌种名称：蒙氏肠球菌
[0031] 拉丁名：（Enterococcus mundtii)
[0032] 菌株编号：QH1-255
[0033] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0034] 保藏机构简称：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登记入册编号：CCTCC NO :M 2015253
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1、蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii)QH1-255的分离与鉴定
[0041] -、菌株QH1-255的分尚与筛选
[0042] 取中国青海省尖扎县野生小麦10g，放入90mL无菌水，震荡10秒，吸取ImL液体放 于I. 5mL离心管，依次稀释101，103, IO5倍，取稀释液体20 μ L分别涂布到MRS固体培养基 上，30°C厌氧培养48小时，取单菌落MRS固体培养基扩大培养，将获得的其中一株菌编号为 QH1-255。
[0043] 其中，所述MRS固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬 酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L。
[0044] 二、菌株QH1-255的鉴定
[0045] 从以下几个方面对步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-255进行鉴定。
[0046] 1、形态学鉴定
[0047] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-255单菌落，革兰氏染色后，显微镜下观察单 菌落形状呈圆形。
[0048] 2、生理生化特征鉴定
[0049] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-255革兰氏染色阴性，不产过氧化氢，不能利 用葡萄糖发酵产气，为同型发酵菌株。
[0050] 利用API 50CH检测菌株QH1-255对不同碳源的发酵利用情况。结果如表1所示。 可见，菌株QH1-255可以利用核糖，木糖，甘露糖，苦杏仁苷，熊果苷，七叶灵，水杨苷，纤维 二糖，乳糖，蔗糖，N-甲基-葡萄糖胺，果糖，葡萄糖，麦芽糖，L-阿拉伯糖，海藻糖作为碳源 进行发酵；不可以利用甘油，L-海藻糖，α -甲基-D-葡萄糖苷，D-松二糖，D-阿拉伯醇，松 三糖，棉子糖，糖原，2-酮基-葡糖酸盐，D-来苏糖，鼠李糖，D-阿拉伯糖，L-木糖，β-甲 基-木糖苷，菊粉，山梨糖，半乳糖醇，纤维醇，淀粉，D-海藻糖，木糖醇，赤藓糖醇，葡糖酸 盐，L-阿拉伯醇，核糖醇，5-酮基-葡糖酸盐作为发酵碳源；可以微弱利用半乳糖、甘露醇、 山梨醇、蜜二糖、α -甲基-D-甘露糖苷、龙胆二糖、D-塔格糖作为碳源进行发酵。
[0051] 表1菌株QH1-255对不同碳源的发酵利用情况
[0052]
[0053] 注：" + "表示阳性，即能利用；表示阴性，即不能利用；"w"表示弱阳性，即微弱 利用。
[0054] 3、16S rDNA序列同源性分析
[0055] 提取步骤一所得的菌株QH1-255的基因组DNA，以其为模板，采用细菌通用引物进 行PCR扩增，获得菌株QH1-255的16S rDNA片段，并进行序列测定，其序列为序列表中序 列 1。将序列 1 在 GenBank 数据库中进行 BLAST(htt