一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测奶源动物以及原料乳中致病性金黄色葡萄球菌的试剂盒及 其检测方法，属于微生物检测技术，适用于奶源动物致病性金黄色葡萄球菌感染以及原料 乳中致病性金黄色葡萄球菌污染的定性检测。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称SA)，也称"金葡菌"，是一种革兰 氏染色阳性球菌，直径〇. 8 μ m，在显微镜下排列成葡萄串状。金葡菌在自然界中无处不在， 空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可以找到，是引起细菌性食物中毒的主要病原菌之 一，且在国家鲜乳标准中列为不得检出的项目。并且金葡菌也是引起慢性/隐性奶牛乳房 炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济 损失。因此检测牛奶中的金葡菌不仅是保证食品安全的需要，同时也可以应用于监测奶牛 的健康程度，从根本上提高奶牛产业的经济效益。
[0003] 金黄色葡萄球菌在致病过程中产生多种毒力因子，包括蛋白毒素和荚膜多糖，其 中一种重要的蛋白毒素是α-毒素（也称α溶血素），它是由大多数金黄色葡萄球菌致病 菌株产生的，能够在宿主细胞膜上打孔并产生溶血的胞外蛋白。多年的研宄表明，各种动物 和人的红细胞、血小板、单核细胞、中性粒细胞、T细胞和上皮细胞等都容易受α -毒素溶血 效应的影响。另外本实验室的研宄涉及到从不同地区患有临床型或者隐型乳房炎的奶牛所 产的牛奶里分离金葡菌，并通过检测这些菌株，证明alpha-toxin基因广泛存在于这些不 同基因型、血清型的金葡菌中，且基因高度保守。
[0004] 在检测牛奶中所含金葡菌的方法上，目前国内外主要采用FDA、A0AC、ISO和GB等 标准对金葡菌进行检测，整个过程一般需要3-5天，且操作复杂，已经不能满足微生物快速 准确检测的现实需要。因此，迫切需要建立新的快速检测技术和方法。
[0005] 近年来，免疫学和分子生物学等方法的发展和应用，使金葡菌的快速检测有了很 大发展。但是，免疫学方法如ELISA、胶体金等，在成本、敏感性等方面尚不理想；而分子生 物学检测，如PCR、分子探针等，操作简便、敏感性高、特异性强，已经被越来越多的应用。现 在市场上大多数检测金葡菌的PCR或者分子探针方法所采用的引物一般是根据耐热核酸 酶（nuc)基因、细菌16S rRNA或者23S rRNA基因设计的，而这些检测方法并不能直接反 映所检测出的金葡菌的毒力。因此通过检测alpha-toxin基因能够更好的检测出牛奶中是 否存在致病性强的金黄色葡萄球菌。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种从牛奶中直接分离病原微生物的快捷方法，再结合使 用针对alpha-toxin基因设计的3对特异引物，通过PCR方法检测alpha-toxin基因，从而 达到快速检测牛奶中是否存在致病性金葡菌的目的。
[0007] 本发明还进一步提供了利用该检测方法在制备从牛奶中检测致病性金葡菌的检 测试剂盒的应用，该试剂盒可用于奶源动物以及原料乳中致病性金葡菌的检测，检测方法 简便快捷，适用于工业化需要。该试剂盒包括：（1)牛奶中微生物的提取试剂：Pecoll溶液 1，密度为 I. 050g/mL ;Pecoll 溶液 2,密度为 I. 123g/mL ;NaCl 溶液，浓度为 0. 15M ; (2)PCR 检测试剂：2XTaq DNA MasterMix ;ddH20以及3对alpha-toxin基因的引物；⑶阳性对 照：金葡菌基因组DNA ;⑷阴性对照：大肠杆菌基因组DNA ; (5)空白质控标准品；CldH2O。其 中：
[0008] 3对引物是根据金葡菌的alpha-toxin基因设计的，所述alpha-toxin基因序列如 SEQ ID NO. 1所示。引物序列如下：
[0009] 第一对引物：
[0010] Fl :5' -ACGGTAATGTTACTGGTGATGA-3'（SEQ ID NO. 2)
[0011] Rl :5' -CTGTAGCGAAGTCTGGTGAA-3'（SEQ ID NO. 3)
[0012] 第二对引物：
[0013] F2 :5' -GGTGCAAATGTTTCGATTGGTC-3'（SEQ ID NO. 4)
[0014] R2 :5' -GCGAAGTCTGGTGAAAACCC-3'（SEQ ID NO. 5)
[0015] 第三对引物：
[0016] F3 :5' -TCCTGTCGCTAATGCCGCAGA-3'（SEQ ID NO. 6)
[0017] R3 :5' -TGCACCAATAAGGCCACCAA-3'（SEQ ID NO. 7)
[0018] 阳性对照是采用本实验室用国标法分离鉴定的高致病性金黄色葡萄球菌株中提 取的基因组DNA。
[0019] 阴性对照是采用本实验室从BL21大肠杆菌株中提取的基因组DNA。
[0020] 本发明所提供的具体检测方法：
[0021] (1)提取牛奶中的微生物：
[0022] 1)取待检牛奶样品与Percoll溶液1按0· 5~I : 1的体积比混勾，室温4, 500g 离心15min，弃去上层悬浮物；
[0023] 2)配制Pecoll梯度溶液：按I : 1的体积比将Percoll溶液1缓慢加 Percoll溶 液2上层，注意不要冲动下层梯度；
[0024] 3)将步骤1)中所得物缓缓加入到步骤2)中准备好的Percoll梯度溶液的表面 上，室温14, OOOg离心5min，小心收集上层乳白色溶液；
[0025] 4)将步骤3)中的所得物按0. 3~0. 5 : 1的体积比加入至NaCI溶液中，混匀后 室温15, OOOg离心5min，弃上清液；
[0026] 5)沉淀用适量CldH2O洗涤，室温13, OOOg离心5min，弃上清液；
[0027] 6)用所提牛奶样品1/50体积的CldH2O重选沉淀，获得奶样中微生物的浓缩液，作 为DNA模板。
[0028] (2) PCR法扩增检测待检样本中的alpha-toxin基因，具体步骤如下：
[0029] 1)按照以下比例制备反应体系：
[0030] ddH20 0. 5 μ L
[0031] 2 X Taq DNA MasterMix 12. 5 μ L
[0032] 上游引物（F1，F2 或 F3) (10μΜ) IuL
[0033] 对应的下游引物（F1，F2或F3) (10μΜ) IyL
[0034] DNA 模板 IOyL
[0035] 2) PCR反应循环参数如下：
[0036] 预变性：95°C 5min ;
[0037] 30 个循环：95°C 45s ;58°C 45s ;72°C Imin ;
[0038] 延伸：72°C 15min。
[0039] PCR反应产物将用于电泳检测鉴定，也可以保存于4°C。
[0040] (3)电泳检测鉴定
[0041] 将步骤（2)PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在凝胶成像仪中观 察结果并拍照，如果检测到期待大小的特异性条带：如应用第一对引物得到330bp条带，应 用第二对引物得到278bp条带，或应用第三对引物得到409bp条带则证明所检样品中存在 致病性金葡菌。
[0042] 应用本发明的从牛奶中快速提取并检测致病性金葡菌的方法所制备的试剂盒，可 以快速准确的检测牛奶中是否存在致病性金葡菌，检测方法简便快速、特异性和灵敏度高。 整个检测过程在同一天可以完成，与常规培养检测法相比大大提高了检测效率。
【附图说明】
[0043] 图1应用3对alpha-toxin基因特异性引物PCR扩增DNA片段检测结果，其中金 葡菌DNA模板采用按国标法分离鉴定，来自内蒙古奶样中分离的高致病性金葡菌NM006的 菌液（浓度为lXl〇 3CFU/10yL) :l)Marker DL2000,2)是应用第一对引物扩增金葡菌，3) 是应用第二对引物扩增金葡菌，4)是应用第三对引物扩增金葡菌，5)是应用第一对引物扩 增ddH 20,6)是应用第二对引物扩增ddH20,7)是应用第三对引物扩增ddH20。
[0044] 图2牛奶样品检测结果图：标准金葡菌株1株以及按国标法分离鉴定的19株金葡 菌株按IX IO4CFUA). 5mL人工污染无菌鲜牛奶利用第二对引物检测的检测结果，包括图2-1 和图2-2,其中：
[0045] 图2-1 :l)Marker DL2000,2)是高致病性金葡菌基因组DNA，3)是陕西奶样中分离 的金葡菌SX12003,4)是山东奶样中分离的金葡菌SD009,5)是内蒙古奶样中分离的金葡菌 NM〇〇6,6)是内蒙古奶样中分离的金葡菌NM005,7)是黑龙江奶样中分离的金葡菌HJ35,8) 是黑龙江奶样中分离的金葡菌HJ31，9)是河北奶样中分离的金葡菌HB31，10)是河北奶样 中分离的金葡菌HB0823-2，11)是河北奶样中分离的金葡菌HB49-3，12)是甘肃奶样中分离 的金葡菌GS22，13)是甘肃奶样中分离的金葡菌GS38，14)是购买的标准金葡菌ATCC29213， 15)是无菌鲜牛奶，16)是大肠杆菌基因组DNA，17)ddH 20。
[0046] 图2-2 : DMarker DL2000, 2)是高致病性金葡菌基因组DNA，3)是浙江奶样中分离 的金葡菌Zh_QS13,4)是浙江奶样中分离的金葡菌Zh_JH006,5)是浙江奶样中分离的金葡 菌Zh_HZ041，6)是重庆奶样中分离的金葡菌CQ339,7)是新疆奶样中分离的金葡菌XJ041， 8)是新疆奶样中分离的金葡菌XJ048,9)是上海奶样中分离的金葡菌SH008，10)是上海奶 样中分离的金葡菌SH004，11)是无菌鲜牛奶，12)是大肠杆菌基因组DNA，13)ddH 20。
[0047] 图3试剂盒特异性鉴定图：按国标法分离鉴定的7株非金葡菌和金葡菌分别 按I X I O4CFUzU 5mL人工污染无菌鲜牛奶利用第一对引物检测的检测结果，其中：1) MarkerDL2000,2)是高致病性金葡菌基因组DNA，3)是金黄色葡萄球菌NM006的对照，4) 是甘肃奶样中分离的非金葡菌NSA_QZ55和金黄色葡萄球NM006菌混合，5)是甘肃奶样中 分离的非金葡菌NSA_QZ55,6)是陕西奶样中分离的非金葡菌NSA_5100152和金黄色葡萄 球NM006菌混合，7)是陕西奶样中分离的非金葡菌NSA_5100152,8)是黑龙江奶样中分离 的非金葡菌NSA_2K52和金黄色葡萄球NM006菌混合，9)是黑龙江奶样中分离的非金葡菌 NSA_2K52，10)是黑龙江奶样中分离的非金葡菌NSA_1K212和金黄色葡萄球NM006菌混合， 11)是黑龙江奶样中分离的非金葡菌NSA_1K212，12)是北京奶样中分离的非金葡菌NSA_ XY08001和金黄色葡萄球NM006菌混合，13)是北京奶样中分离的非金葡菌NSA_XY08001， 14)是北京奶样中分离的非金葡菌NSA_FM118和金黄色葡萄球NM006菌混合，15)是北京奶 样中分离的非金葡菌NSA_FM118,16)是河北奶样中分离的非金葡菌NSA_HB47和金黄色葡 萄球NM006菌混合，17)是河北奶样中分离的非金葡菌NSA_HB47，18)是无菌鲜牛奶，19)是 大肠杆菌基因组DNA，20) ddH20。
[0048] 图4试剂盒敏感度鉴定图：按国标法分离鉴定的1株金葡菌分别 按 I X 102CFU/0. 5mL，I X 103CFU/0. 5mL，I X 104CFU/0. 5mL，I X 105CFU/0. 5mL 和 I X 106CFU/0. 5mL浓度人工污染无菌鲜牛奶，利用第一对引物检测的结果：1)是Marker DL2000,2)是高致病性金葡菌基因组DNA，3)是用