一种当归scar分子标记及其鉴定方法和特异性引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种当归SCAR分子标记及其鉴定方法和 特异性引物对。
【背景技术】
[0002] 当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(01iv. )Diels的干燥根。具有补血、活 血、调经止痛、润燥滑肠的作用，早在两千多年前，中国古代人民已用它治疗疾病，至今，当 归在临床仍有广泛的用途，素有"十方九归"之说，故其市场需求量很大，市场面临着优质当 归供不应求的局面。当归由于其使用背景和来源复杂，国内以"当归"、"土当归"、"野当归" 之名作当归正品使用的"同名异物"较多，替代、以假充真现象愈加频繁。其中，与正品当归 形态特征相似的伞形科植物如：独活属的物种、柴胡属物种、当归属种的阿坝当归、东当归、 欧当归等常作为当归的替代品和伪品混用，民间使用比较混乱。这些植物的化学成分与正 品当归相差甚远，应当慎用。
[0003] 现有的对当归的鉴别主要采用显微鉴别和理化鉴别等传统手段。而目前市售药材 多为加工品，当归与其混伪品的表面性状、显微特征甚至化学成分都极其相似，在实际运用 中要进行准确鉴别难度极大，且存在主观性大，通用性差，且对观察者经验要求高等缺陷， 不利于标准化、规范化方法的建立及普及。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、准确且特 异性强等特征，为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。
[0004] 随着分子标记技术的发展，目前少数文献报道了对当归的分子鉴定：李明 等（当归及其混伪品的过氧化物同工酶电泳鉴别[J].中药材，2000,23(4) :200.)利 用过氧化物同工酶对当归及其混伪品鉴定，但这种方法也仅限于采集新鲜的植株进 行，对药材饮片无法鉴别。Feng等和本研宄小组（FENG T，LIU S，HE XJ. Molecular authentication of the traditional Chinese medicinal plant Angelica sinensis based on internal transcribed spacer of nrDNA. Electronic Journal of Biotechnology, 2010, 13 (I) : 1-13。张春，王晓丽，税王先，朱焊，庄元春·中药当归及其混 伪品的rDNA ITS序列分析与鉴别，四川农业大学学报，2011，29 (2) :218-224.)利用ITS序 列对当归及其混伪品进行了鉴别，但是需要对序列进行测序和聚类分析方能区别。鉴别过 程较为繁琐，且测序费用昂贵，需要时间较长也增加了检测成本。本研宄小组利用ISSR技 术进行了当归的分子鉴定（张春，朱烨，何颖，庄元春，基于内部简单重复系列_ISSR_分析 的当归分子鉴定.中国药学杂志，2014, 49 (10) :812-816)。该方法需要对多条引物进行扩 增，并对电泳条带进行数据分析才能得出可靠结果。
[0005] 综上，上述对当归的传统鉴别方法，在实际运用中要进行准确鉴别难度极大，且存 在主观性大，通用性差，且对观察者经验要求高等缺陷。而分子鉴别手段比较准确可靠，但 都需要测序或是大量PCR和电泳及后期数据处理，也不利于规模化标准化建立。
[0006] 因此有必要开发一种结果准确且鉴定过程简便快速的分子鉴定方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种结果准确灵敏，鉴 定过程简便快速的当归鉴定方法。
[0008] 为达到以上目的，本发明的发明人在对大量的ISSR引物筛选过程中，寻找出正品 当归的特异性扩增条带并转化为SCAR标记，提供了对当归鉴别较为快速，简便，廉价的方 法。
[0009] 本发明提供了一种当归SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0010] 本发明还提供了一种用于检测本发明所述的当归SCAR分子标记的PCR扩增特异 性引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
[0011] 上游引物：5' -ACCCATTTGTAAACATAGCC-3'（SEQ ID No :2 所示序列）
[0012] 下游引物：5' -CAGATTCTCCTTCCACCC-3'（SEQ ID No :3 所示序列）。
[0013] 在引物设计阶段，发明人考虑到在实际应用过程中，扩增易于进行且特异性较好， 扩增区段最好大于500bp。为了降低引物合成成本，引物长度限制在20bp左右，末端不能含 有3个以上连续碱基，特别是AAA和TTT。引物之间不能形成二聚体，自身不能形成发夹结 构，退火温度不能低于50度。按照以上原则发明人设计了 10对引物，并分别对这10对引 物的目的片段扩增效果进行验证，发现本发明所提供的PCR扩增特异性引物与其他9对引 物相比取得了最佳的扩增效果。例如所涉及的10对引物的其中一对的序列为：
[0014] 826L: 5 ' -GTAAACATAGCCGCACAAA-3 '，
[0015] 826R: 5 ' -CTGCCAAGCCTCACAAAC-3 '。
[0016] 但这对引物扩增后出现了 2条扩增条带，特异性不够好，因此被淘汰。
[0017] 本发明的另一个方面提供了一种当归SCAR分子标记的鉴定方法，所述方法包括： 以待测样品的总DNA为模板，利用本发明所提供的引物对进行PCR扩增反应，并对扩增产物 进行电泳检测。
[0018] 可选的，所述PCR扩增反应的体系为：
[0019] 试剂 体积成 终浓度 DNA模板 1μ￡ 30 ng/^iL l〇x反应缓冲液 2μ【 dNTP 2μL 0.2 mmol-L'1 MgC 12 ljiL 1.5 mmol-L"1
[0020] 正向引物 IpL 1.0 μιτιο?-?'1 反向引物 IpL I-Opmol-L4 Ex Taq酶 0.2μΙ, 1.25 U 总计： 20μL
[0021] 可选的，所述PCR扩增反应的程序为：
[0022] 95°C预变性 4min ;94°C变性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；72°C 后延伸8min。
[0023] 本发明通过上述引物、反应体系、反应程序能够取得最佳的对当归SCAR分子标记 的鉴定效果，能够更加准确快速的将当归与其他样品分开。
[0024] 可选的，所述待测样品选自当归、阿坝当归、东当归、欧当归、紫花前胡、白芷、北柴 胡、白亮独活、独活、藁本、川芎、川明参、羌活、峨眉当归、小茴香、防风、鸭儿芹和野胡萝卜 中的一种或多种。
[0025] 本发明还提供了一种用于鉴定当归的试剂盒，包括本发明所提供的特异性引物 对。
[0026] 利用本发明所提供的分子标记，可以准确的将正品当归与形态特征相似的植物区 分开，利用本发明所提供的引物和方法进行当归SCAR分子标记鉴定，PCR扩增的特异性好， 在实际应用中，无需在当归鉴别时筛选大量的引物，也无需根据获得的数据估算样品间的 遗传相似性和构建遗传聚类图谱，具有快速，简便和低成本的优越性。
【附图说明】
[0027] 图1为用引物UBC826对当归及其混伪品29个样本扩增电泳图
[0028] M:DL2000DNA marker,数字编号同表1，箭头所指为当归特异扩增条带。
[0029] 图2本发明所提供的特异性引物对对当归及其混伪品29个样本的扩增电泳图
[0030] M:DL2000DNA marker,数字编号同表 1。
【具体实施方式】
[0031] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0032] 实施例1
[0033] I. I DNA的提取与检测
[0034] 取IOmg经硅胶快速干燥的待测材料在液氮中研磨成细粉，使用DNA提取试剂盒 (北京天根DP305)提取总DNA。过1%凝胶电泳，全自动凝胶成像系统分析DNA的完整性及 纯度。用微