一种研究水稻与病原物互作模式的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种研宄水稻与病原物互作模式的方 法，更具体为基于转录组、蛋白质组（iTRAQ)及miRNA组联合研宄水稻-稻瘟病菌互作机制 的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza Sativa)是世界上重要的粮食作物之一，养活着全球半数以上的人 口。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病，是水稻生产上的重要限制因素， 它具有传播速度快、发生范围广、危害严重等特点。随着水稻和稻瘟病菌全基因组测序计划 的相继完成，水稻-稻瘟病菌的互作机制研宄已成为植物-病原物互作机制研宄的模式系 统。
[0003] 水稻与稻瘟病菌的互作是一个十分复杂和动态的过程，涉及到众多基因的表达与 调控而形成的连续信号逐级传导的过程，主要包括三个阶段：信号分子的产生和识别，通常 有JA、SA及ET等植物激素类信号，Ca 2+、活性氧（ROS)及一氧化氮（nitric oxide，NO)等 第二类信使类信号，谷胱甘肽（glutathione，GSH)等小分子肽类、脂类和糖类等信号分子； 细胞内信号的传导，如跨膜GTP结合蛋白、胞间Ca 2+通道、钙依赖性蛋白激酶CDPK、促分裂 原活化蛋白激酶MAPK的级联以及磷酸酶催化的蛋白质的磷酸化/去磷酸化；防卫反应的开 启和系统获得抗性的产生。而每次的传导都可产生相应的生化反应，从而发挥相应的生理 功能，完成特定的生物学效应。
[0004] 前人已经分别采用多种方法进行了水稻响应稻瘟病侵染的差异组学研宄，然而都 是单一的转录组或蛋白质组学的研宄。其中，基因芯片技术主要揭示HiRNA水平的变化，单 纯依赖该技术并不能客观真实地揭示植物与病原物的具体互作机制，而蛋白质组学技术也 大多数采用基于2D电泳分离和质谱鉴定联合应用，属于对于一个细胞或组织的蛋白质进 行的定性研宄，仅能确定蛋白质的身份但不能对蛋白质的功能给出最终定论。虽然差异蛋 白质组学能显著克服差异转录组学的局限性，但实际上蛋白的表达变化与基因的表达变 化并不十分一致，这可能是由mRNA的剪接、翻译调控或翻译后加工和蛋白质降解等因素 引起的，这无疑会影响对植物与病原物的互作机制的真实阐明，而miRNA的鉴定则可以很 好的将蛋白质组学与转录组学的结果有机的统一起来。因此，采用单一的方法与技术去研 宄稻瘟病抗病性反应，难以真正的揭示其复杂的分子抗性机制，而综合利用转录组学、定量 蛋白质组学（iTRAQ)进行差异组学的分析，两者不匹配的地方进一步借助miRNA进行分析 以确定转录后水平或者蛋白质翻译水平是否被调控所导致的，有望较为全面真实的揭示水 稻-稻瘟病的具体互作机制以进一步阐明植物抗病的分子机理。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供一种研宄水稻与 病原物（稻瘟病菌）互作模式的方法，用以克服现有单一技术的研宄效果不准确的问题。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种研宄水稻与病原物互作模式的方法， 综合应用转录组、蛋白质组（iTRAQ)及miRNA组研宄水稻响应病原物侵染的互作模式的方 法，其具体步骤包括：
[0007] A.别取接种病原物前后不同时间点的抗病材料及感病材料的水稻叶片总RNA、 Small RNA及总蛋白；
[0008] B.分别进行差异表达谱分析、差异蛋白质组学（iTRAQ)分析及miRNA鉴定及其靶 基因分析；
[0009] C.将三种方法鉴定出差异基因、蛋白、miRNA靶基因进行整合、关联以揭示水稻与 病原物互作过程中所激活或抑制的抗、感病反应途径，从而可以较为系统的阐明水稻-稻 瘟病菌的互作机制。
[0010] 步骤A所述的病原物优选为稻瘟病菌。
[0011] 步骤A所述的接种稻瘟病菌前后不同时间点优选为Oh和24h两个时间点。
[0012] 步骤A的具体步骤包括：分别取接种稻瘟病菌前后Oh和24h两个不同时间点的 抗病材料及感病材料的叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，并分别进行总RNA、总蛋白及Small RNA的制备及相应的质量检测。
[0013] 步骤B中所述的差异表达谱分析的具体步骤包括：使用NucIeoSpin K RNA Clean-up (MN)纯化步骤A所得的RNA并进行双链cDNA的合成、纯化；然后体外转录 合成生物素标记cRNA，纯化cRNA后进行cRNA的片段化处理；使用 AffymetHx Λ Hybridization Oven 640 将试验材料 cRNA 与芯片杂交；通过 Affymetrix? Fluidics Station 450 进行洗脱、染色；使用 Affymetrix+GeneChip? Scanner3000 扫描芯片，用 AffymetrixK'Ge_neChipK) Operating Software VersionL 4软件分析芯片杂交图像，把图 像信号转化为数字信号，并用dChip软件（http://www. dchip. org)做校正和标准化处理； 每个探针在不同时间点和不同处理间比较以确定差异表达相关基因。
[0014] 步骤B中所述的差异蛋白质组学（iTRAQ)分析的具体步骤包括：将步骤A所得的 蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC-MS质谱分析，进一步对所得 的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，进行GO聚类分析，选取差异倍数>1. 2或〈0. 8、 p-value〈0. 05的蛋白进行进一步分析初步确定差异表达相关蛋白。
[0015] 步骤B中所述的miRNA鉴定及其靶基因分析的具体步骤包括：对步骤A所回收的 18_30nt small RNA与5' adaptor、3' adaptor连接，并进行反转录；反转录产物于Solexa High-throughput Sequencer (Illumina, USA)进行测序，将 Solexa 测序所得的 35nt 序列， 通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度及分布过程完成初级分析，进一步对初级分 析所得到的序列作分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息。对差异miRNA进行 靶基因预测以得到可能调控的靶基因信息，并对靶基因进行Go分类及KEGG通路分析。
[0016] 步骤C的具体步骤包括：对差异表达谱鉴定的差异基因、差异蛋白质组学鉴定的 差异蛋白及miRNA预测的靶基因进行三者的关联分析，以较为全面地揭示水稻与稻瘟病菌 互作的复杂分子机制。
[0017] 步骤C中所述的差异表达谱鉴定的差异基因为差异倍数为2倍以上的基因。
[0018] 步骤C中所述的差异蛋白质组学鉴定的差异蛋白为差异倍数为I. 2倍以上的蛋 白。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0020] 本发明能够较完整的鉴定出参与水稻-稻瘟病菌互作过程中的差异基因/蛋白， 本发明实施例利用该方法鉴定了一些水稻响应稻瘟病侵染过程中的发生变化的基因/蛋 白；本发明方法对深入揭示水稻-稻瘟病互作机制提供了一个方法借鉴；在利用转基因技 术培育抗稻瘟病品种上具有重要的参考价值。其优点为：①能快速和有效地筛选到与水稻 抗病相关联的候选基因；②本发明很好的利用基因芯片技术、iTRAQ技术及miRNA的深度测 序等这些高通量、准确的组学研宄手段来研宄与水稻抗稻瘟病相关的候选基因/蛋白；③ 可以广泛应用于植物抗病等性状的研宄和开发并且结合转基因技术来培育抗病性强的植 物新品种。
【附图说明】
[0021] 图1差异表达谱鉴定的部分差异基因的GO功能注释分析；其中注：
[0022] 细胞组件（1-细胞、2-细胞部分、3-膜、4-细胞外区、5-细胞外区部分、6-高分 子配合物、7-膜蛋白、8-细胞器、9-细胞器部分、10-合成酶、11-合成酶部分）分子功能 (12-抗氧化、13-结合、14-催化活性、15-电子载体、16-酶调节、17-金属伴侣、18-转运活 性、19-营养存储、20-结构分子、21-转录调节、22-翻译调节、23-运输、生物学途径（24-解 剖结构的形成、25-生物粘连、26-生物调节、27-细胞组件发生、28-细胞组件组织、29-细胞 进程、30-死亡、31-发育过程、32-定位的建立、33-生长、34-免疫过程、35-定位、36-运动、 37-代谢过程、38-多种生物过程、39-多细胞生物过程、40-色素沉着、41-生殖、42、生殖过 程、43-应激反应、44-周期性过程）
[0023] 图2 iTRAQ差异蛋白质