一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法。
【背景技术】
[0002]水蛭素是水蛭体内的一种蛋白质，含65个氨基酸残基和3对二硫键，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，故有抗凝血作用。
[0003]天然水蛭素的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干水蛭中分离提取水蛭素。传统的水蛭素的获得是对水蛭的一次性掠夺，对水蛭的野生资源造成巨大的浪费，不利于水蛭养殖业的发展。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的问题，本发明提供一种具有工艺合理、操作方便实用、水蛭素成品的质量稳定性好和收率较高的特点，且能够避免传统方法对水蛭的一次性掠夺，保护了水蛭的野生资源，又带动了水蛭养殖业的发展。
[0005]为达到上述目的，本发明的技术方案如下:
一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用；
所述的诱导物质由蚯蚓提取液10?300ml、壳聚糖5?50g、黄芪多糖I?20g、葡萄糖粉I?30g组成；
所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1:1~2，催吐剂的用量与水蛭活体之间的重量比为1:1?10 ；
B、解冻上述水蛭素粗品，取250~300ml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸20-30ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液；
C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。
[0006]所述的水蛭充分饥饿的时间为15?20天，水蛭吸饱诱导物质的时间为10?60分钟。
[0007]所述的硫酸锌质量分数为0.05-1%,所述的乙醇质量分数为5~10%。
[0008]所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下:
取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。
[0009]所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下:
取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
[0010]本发明的有益效果如下:
1.本发明的诱导物质是一种纯天然的诱导液，诱导液中的成分无毒、无害、无腐蚀性，这样有利于天然水蛭素的提取和分离纯化；诱导液中含蚯蚓提取液，其含有多种微量元素及活性酶类物质，能够诱导吸血水蛭吮吸。
[0011]2.本发明中的壳聚糖具有良好的营养价值和抑菌消炎防腐等作用，可有效提高在提取天然水蛭素粗品过程中吸血水蛭存活率。
[0012]3.本发明提高了吸血水蛭的免疫力，在特异性诱导液中添加了黄芪多糖和葡萄糖，这样可为吸血水蛭及时补充其所需的营养和能量，这为反复进行活体水蛭提取天然水蛭素粗品打下了坚实的基础，同时，黄芪多糖为免疫促进剂或调节剂，可增强机体免疫功能，改善机体肠道内环境，促进有益群菌乳酸杆菌的生长，以维持肠道微生态区系的平衡和稳定，从而有利于防治各种病毒感染、细菌性疾病。黄芪多糖的加入可有效防治在提取天然水蛭素粗品过程中因挤压损伤水蛭口腔而引起的条件性感染性疾病，从而提高了吸血水蛭提取其唾液即天然水蛭素粗品后的成活率，减少了死亡率，降低生产成本。
[0013]4.本发明工艺简单，天然水蛭素的提取率稳定，提取总量较高。采用本发明的方法，一条活体水蛭可多次提取天然水蛭素粗品，避免传统方法对水蛭的一次性掠夺，保护了水蛭的野生资源，又带动了水蛭养殖业的发展。
【具体实施方式】
[0014]为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0015]实施例1
本发明的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用；
所述的诱导物质由蚯蚓提取液10ml、壳聚糖5g、黄芪多糖lg、葡萄糖粉Ig组成；
所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1:1，催吐剂的用量与水蛭活体之间的重量比为1:1 ;
B、解冻上述水蛭素粗品，取250ml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸20ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液；
C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。
[0016]所述的水蛭充分饥饿的时间为15天，水蛭吸饱诱导物质的时间为10分钟。
[0017]所述的硫酸锌质量分数为0.05%，所述的乙醇质量分数为5%。
[0018]所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下:
取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。
[0019]所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下:
取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
[0020]实施例2
本发明的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用；
所述的诱导物质由蚯蚓提取液100ml、壳聚糖25g、黄芪多糖10g、葡萄糖粉1g组成；所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1:1.5，催吐剂的用量与水蛭活体之间的重量比为1:5 ;
B、解冻上述水蛭素粗品，取280ml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸25ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液；
C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。
[0021]所述的水蛭充分饥饿的时间为15?20天，水蛭吸饱诱导物质的时间为30分钟。
[0022]所述的硫酸锌质量分数为0.5%，所述的乙醇质量分数为8%。
[0023]所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下:
取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。
[0024]所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下:
取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
[0025]实施例3
本发明的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用；
所述的诱导物质由蚯蚓提取液200ml、壳聚糖40g、黄芪多糖15g、葡萄糖粉20g组成；所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1:1，催吐剂的用量与水蛭活体之间