一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物免疫学领域，尤其涉及一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]鸭病毒性肝炎(DuckViral Hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck HepatitisVirus, DHV)引起的一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。鸭病毒性肝炎分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型:1型、II型和III型。其中，血清I型鸭肝炎病毒(DHV-1)又称鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，是目前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。
[0003]鸭甲型肝炎病毒目前发现有三种基因型，即DHAV-l、DHAV-2和DHAV-3，根据报道，我国目前流行的主要是DHAV-1，三种基因型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，核衣壳呈20面体对称，直径为20?40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，核酸为不分节段的单股正链RNA。该病毒对乙醚、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸铵、常用消毒剂等有一定程度的抵抗力；能耐受PH3.0的酸性环境；对热也有较强抵抗力，56°C加热I小时仍有部分病毒存活。鸭甲型肝炎病毒不能凝集任何动物的红细胞，可在鸭胚和鸡胚的绒毛尿囊腔及鸡胚组织、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鹅胚肾细胞等中增殖。
[0004]在免疫学相关的实验研宄和生产实践中，常常涉及到免疫原的制备。其中由于病毒必须在活的宿主细胞中才能增殖，因此获得的病毒材料实际上是病毒与增殖该病毒的宿主成分的一个混合物。当然，在以病毒作为免疫原的用途中，有的可以直接使用该病毒与宿主成分的混合物作为免疫原，如制备灭活苗或弱毒苗的免疫原，但在有的方面，需要尽可能去除宿主成分，如病毒单克隆抗体制备中的免疫原，如尽可能去除宿主成分，将在单克隆抗体的筛选中可减少假阳性的非目标杂交瘤细胞；又如在制备诊断检测用途的病毒多克隆抗体时，需要尽可能去除宿主成分以保证获得的多克隆抗体的特异性，但由于病毒的培养增殖、形态大小、结构组成等方面的特殊性，不可能像纯化细菌那样方便、快速地获得纯的免疫原，目前为止，还没有一个通用、简便的获得较纯净的病毒免疫原的方法；正是由于获得较纯的病毒免疫原的困难，同时也导致获得高特异性的高免血清的困难。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用，旨在解决由于获得较纯的病毒免疫原的困难，同时也导致获得高特异性的高免血清的困难的冋题。
[0006]本发明是这样实现的，一种鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，包括以下步骤:
[0007](I)将鸭肝炎病毒在9?10日龄鸡胚或10?12日龄鸭胚尿囊腔接种进行增殖，收集36?60h内死亡并且胚体有明显病变的尿囊液，将尿囊液反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清；
[0008](2)将步骤⑴得到的上清与等量氯仿相混合，4°C作用Ih后，5000r/m离心30min，取上清，如此重复两次；
[0009](3)将步骤(2)中经氯仿离心处理后的上清在40000r/m下离心2h，用PBS溶解沉淀得到鸭肝炎病毒免疫原。
[0010]优选地，在步骤(I)中，所述鸭肝炎病毒为血清I型鸭肝炎病毒CH60株或血清3型鸭肝炎病毒CH-1株。
[0011]优选地，在步骤⑶中，所述PBS的用量为:20ml尿囊液对应使用0.5ml炎病毒免疫原含量为1500 μ g/ml?
[0012]本发明进一步提供了一种鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，以上述鸭肝炎病毒免疫原为抗原，包括以下步骤:
[0013](I)将弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂在研钵中研磨均匀，然后边磨边加入抗原，研磨充分后得到免疫注射液；
[0014](2)用弗氏完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液Iml在免疫动物背部皮下多点注射进行第一次免疫；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500 μ g/ml ；
[0015]间隔7?1d后，用弗氏不完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液2ml进行第二次免疫，免疫途经和部位与第一次免疫相同；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500 μ g/ml ；
[0016](3)间隔7?1d后，进行第三次免疫，免疫注射液、免疫剂量和注射方法与第二次免疫相同；
[0017](4)间隔7?1d后用生理盐水稀释鸭肝炎病毒免疫原至其抗原浓度为500 μ g/ml，采用耳缘静脉缓慢注射方式进行第四次免疫，免疫剂量为Iml ;
[0018](5)7d以后，用琼脂扩散法测定血清效价，当免疫动物的琼扩效价达到1:32及以上时，颈动脉无菌采血分离血清，-20°C保存，即为粗制鸭肝炎病毒高免血清。
[0019]优选地，在步骤(5)之后还包括步骤:
[0020](6)取所述粗制鸭肝炎病毒高免血清按1:1?10:1比例加入鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂，充分混匀，37°C感作2h，取出，1200转/min离心，取上清；重复上述操作，每次获得上清用琼脂扩散法测定血清效价，当琼脂沉淀线为单一条带且血清效价不再下降，所获得的血清上清即为鸭肝炎病毒高免血清。
[0021]优选地，在步骤(2)中，所述不完全弗氏佐剂的制备过程为:将石蜡油和羊毛脂按体积比为1:5的比例混合，用超声波使之混匀，高温灭菌后得到。
[0022]优选地，在步骤(4)中，注射液研磨充分的判断标准为:成均匀的乳白色油包水状态的液体，取一滴该液体置于冰水上3?5min不扩散。
[0023]优选地，在步骤￠)中，所述鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂为9?10日龄鸡胚或10?12日龄鸭胚尿的尿囊液按常规方法直接真空冷冻干燥获得。
[0024]本发明进一步提供了上述制备方法得到的鸭肝炎病毒高免血清在鸭肝炎病毒诊断、检测中的应用。
[0025]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明的鸭肝炎病毒免疫原的制备方法条件要求低，操作简单，但获得的免疫原可满足制备特异性抗血清的要求；利用该免疫原制备的高免血清经本发明的技术进一步处理后所获得的特异性抗体，在鸭肝炎病毒诊断、检测中具有高的特异性和应用价值。
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例中DVH人工感染死亡鸭的肝脏的IFA方法检测结果图；
[0027]图2是本发明实施例中DVH人工感染死亡鸭的脾脏的IFA方法检测结果图；
[0028]图3是本发明实施例中DVH人工感染死亡鸭的肾脏的IFA方法检测结果图。
【具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030]实施例1血清I型鸭肝炎病毒免疫原的制备
[0031]1、病毒株
[0032]血清I型鸭肝炎病毒CH60株(鸭甲型肝炎病毒，Duck Hepatitis A Virus)，该病毒株为本申请人分离致弱的病毒株，已申请专利(申请号为201310011872.3)并于2012年11月20号在中国典型培养物保藏中心进行生物材料保藏，保藏编号为CCTCCN0.V201248，保藏地址为:武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。
[0033]2、实验用胚
[0034]9日龄SPF鸡胚。
[0035]3、病毒的增殖
[0036]将血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水稀释5倍后，按常规加入适量双抗(青霉素、链霉素的终浓度分别为1001U/mL和100 μ g/mL)，经尿囊腔接种50枚9日龄鸡胚，0.2ml/胚，同时设立生理盐水阴性对照胚5枚。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37°C孵化6天，每天照胚2次，在生理盐水阴性对照胚不死亡的前提下，弃去24小时内死亡的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，收集24小时后死亡的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，4°C冷藏过夜。在无菌条件下按常规方法吸取尿囊液，混匀，作为病毒免疫原制备的材料。
[0037]4、病毒免疫原的制备
[0038](I)取尿囊液200ml反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清。
[0039](2)上清与等量氯仿相混合，4°C作用Ih后，5000r/m离心30min，取上清，如此重复两次。
[0040](3)上清用Beckman超速离心机40000r/m离心2h，用5ml PBS溶解沉淀后(免疫原含量约为1500 μ g/ml)保存于-20°c备用。
[0041]实施例2血清3型鸭肝炎病毒免疫原的制备
[0042]1、病毒株
[0043]血清3型鸭肝炎病毒CH-1株(禽肝病毒属小RNA病毒科3型鸭甲肝病毒，DuckHepatitis A Vrius type 3，DHAV-3)，该病毒株为本实验室分离的病毒株并于2013年3月25号在中国典型培养物保藏中心进行生物材料保藏，