一株对灰霉病菌有抑制作用的洋葱假单胞菌菌株qba-3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对灰霉病菌有抑制作用的洋葱假单胞 菌菌株QBA-3及其应用。
【背景技术】
[0002] 灰霉病菌是一种世界范围内广泛分布的重要植物病原真菌，该病菌寄主种类繁 多，可侵染番茄、黄瓜等蔬菜以及葡萄、草莓水果等235种植物的茎、叶、花和果实引起灰霉 病。该病害不仅在寄主植物生长季节可以发生，还可以在农产品的储藏期间发生，因此危害 严重。尤其是近年来设施栽培方式的大面积推广，导致该病菌侵染来源广，传播速度快，灰 霉病的发生越来越严重，其发生与流行往往造成严重的经济损失。据报道北方设施番茄灰 霉病的发生普遍较重，一般年份造成的经济损失可达20% -30%，严重的年份50 %以上甚 至绝收。
[0003] 灰霉病菌繁殖速度非常快，产生分生孢子的数量非常多，因此很容易发生变异而 产生抗药性，目前已对农业生产上常用的苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类等多种 杀菌剂产生抗性，因此不仅导致防效的降低，而且导致药剂使用量不断加大。化学药剂的过 度使用，不仅造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还导致环境污染，破坏生态平 衡，影响农业的可持续健康发展。
[0004] 生物防治是植物病害防治的重要措施之一，生防菌通过诱导寄主植物抗病性的产 生或者通过对灰霉病菌的拮抗作用而到达防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草 芽胞杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物对灰霉病菌拮抗作用的相关报道。生物菌剂或制 剂可以减少或替代化学农药的使用，从而既能有效防治病害，又可避免化学农药的使用带 来的负面效应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一株对灰霉病菌有抑制作用的洋葱假单胞菌菌株QBA-3 及其应用。本发明通过筛选获得了一株能够强烈抑制灰霉病菌分生孢子萌发的假单胞菌菌 株QBA-3,通过接种实验，该菌株发酵物的发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果为92. 5%，实 验结果证明该菌株或其制剂对灰霉病的防治具有广阔的应用前景。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0007] 本发明提供了一株对灰霉病菌有抑制作用的洋葱假单胞菌菌株QBA-3,其分类命 名为洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacia，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为 CCTCC M 2015402。
[0008] 所述菌株QBA-3具有鞭毛。
[0009] 本发明还提供了所述的洋葱假单胞菌菌株QBA-3在制备防治灰霉病菌的生防制 剂中的应用。
[0010] 对上述技术方案的进一步改进：所述洋葱假单胞菌菌株QBA-3的菌液和发酵滤液 对灰霉病菌孢子和芽管伸长均具有抑制作用。
[0011] 对上述技术方案的进一步改进：所述洋葱假单胞菌菌株QBA-3的菌液中菌含量为 OD_= 0. 314-0. 565时对灰霉病菌分生孢子的萌发和芽管的伸长均具有较强抑制作用。
[0012] 对上述技术方案的进一步改进：所述洋葱假单胞菌菌株QBA-3的发酵滤液的制备 步骤为：将所述菌株QBA-3接种到液体YEH)培养基中在25°C -28°C下震荡培养72-96h，然 后离心，过滤，获得含有QBA-3菌的发酵滤液。
[0013] 对上述技术方案的进一步改进：所述菌株QBA-3接种到培养基中在130rpm条件下 进行震荡培养。
[0014] 对上述技术方案的进一步改进：经直径为0. 22um的过滤器进行过滤。
[0015] 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明筛选到对灰霉病菌具有抑 制作用的菌株QBA-3,经分类鉴别为洋葱假单胞菌，并经过对灰霉病菌孢子、芽管伸长和离 体叶片的实验，证明本发明获得的菌株QBA-3具有对灰霉病菌的强抑制作用，可以将其制 备成防治灰霉病菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明所述QBA-3菌株的发酵滤液对灰霉病菌孢子萌发抑制的实验结果；
[0017] 图2是本发明所述QBA-3菌株的发酵滤液对灰霉病菌芽管伸长抑制的实验结果。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
[0019] 实施例1
[0020] 一、菌株的分离与筛选
[0021] 2013年3月19日于莱阳市温室采集番茄叶片样品20份，每叶片经75%酒精浸泡 10秒钟，然后在0. 1 %的升汞中浸泡30秒，无菌水冲洗3次，转入灭菌处理的研钵中研磨， 加无菌水稀释成l〇ml，继续用无菌水稀释至KT5倍，分别取IOOul涂LB平板（胰蛋白胨10 克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠5克/升，pH7. 0)，30°C条件下培养。
[0022] 挑取单菌落，并将细菌单菌落接种于YEro培养基中（酵母提取物3克/升，蛋白 胨10克/升，葡萄糖20克/升）25°C 120rpm条件下震荡培养24h，然后25°C 12000rpm条 件下离心，上清经直径为0. 22um的过滤器过滤，将灰霉病菌的分生孢子接种到滤液中静置 培养，以灰霉病菌的分生孢子接种到YEH)中作对照，当对照分生孢子萌发率达90%时检测 细菌滤液中灰霉病菌分生孢子的萌发率，计算出细菌滤液对灰霉病菌分生孢子萌发的抑制 率，筛选出一株对灰霉病菌分生孢子的萌发具有很强抑制力的菌株QBA-3。
[0023] 二、QBA-3菌株的分类鉴定
[0024] 1、分子鉴定：
[0025] 1)、引物：27f/1492r
[0026] 27f :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，（SEQ ID No:l);
[0027] 1492r :5，-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，（SEQ ID No:2);
[0028] 2)、PCR 反应体系如下：2XPCR Master Mix :12. 5ul ;引物 27f :lul ;引物 1492r : Iul ;模板：lul ;ddH20 :9. 5ul ;
[0029] ?0?反应程序如下：94°0预变性51^11;94°0变性3〇8、52°0退火3〇8、72°0延伸 I. 5min ;30个循环，72°C复性；
[0030] 胶回收PCR产物，进行TA克隆，挑取单菌落送测序公司测序。
[0031] 3)、经测序，所述菌株QBA-3的16SDNA片段序列如下：
[0032] 16sDNA 序列（SEQ ID No:3):
[0034] 4)、结论：经过NCBI数据库比对，待检测细菌QBA-3与假单胞菌YJQ-1216S DNA， GenBank