一种产l-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方法和用途，属生物工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] L-肉碱（左旋肉碱，L-Carnitine)又称维生素 Bt，是一种维生素制品，与动物体内 脂肪酸代谢有关。当动物因先天性或代谢性疾病引起体内肉碱缺乏时，会使机体乏力和产 生许多心血管疾病。目前L-肉碱除了以强化营养方式用于婴儿和体弱多病者外，还作为药 物用于降低血脂、减肥和医治心血管疾病，由于其疗效显著正引起人们的极大兴趣与关注。 近年来，L-肉碱被广泛应用于医药、保健和食品等领域，被瑞士、法国、美国和世界卫生组织 规定为法定的多用途应用剂，具有很大的应用市场。
[0003] L-肉碱的生产方法主要有化学合成法、直接提取法、微生物发酵法和酶转化法等。 目前，国内主要采用化学合成法生产，首先合成DL-混旋肉碱，然后进行拆分得到L-肉碱， 该方法环境污染较大，并且D-肉碱副产物废弃造成资源浪费。而直接从牛肉等提取法，成 本太高产量太低，几乎没有应用价值。微生物发酵法和酶转化法是最有应用价值的方法， 目前商业化使用的底物主要有γ-丁基甜菜碱和巴豆甜菜碱。CN101014709A使用粗糙脉 孢菌来源的γ-丁基甜菜碱羟化酶，利用γ-丁基甜菜碱为底物进行酶转化生产L-肉碱， 该方法涉及的酶纯化步骤繁多，酶转化反应辅助因子众多，生产成本太高。CN101068925将 来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-Ν-赖氨酸-甲基转移酶、6-Ν-三甲基赖氨酸羟 化酶、3-羟基-6-Ν-三甲基赖氨酸醛缩酶、γ-三甲基氨基醛脱氢酶与γ-丁基甜菜碱羟 化酶等五个编码基因构建到大肠杆菌的Τ7过表达质粒中，转入宿主大肠杆菌BL21 (DE3)体 内，在含有赖氨酸的培养基中生产L-肉碱的产量为19. 8mg/L。巴豆甜菜碱为底物的转化 方法有其独特优点，底物便宜，且可利用拆分废物D-肉碱进行脱水制备，但一般菌株均不 耐巴豆甜菜碱，需经过大量的筛选工作获得高耐受性的菌株。EP0457735A1使用筛选的奇 异变形杆菌能转化底物浓度为12 %的巴豆甜菜碱生成L-肉碱，摩尔转化率为40~43%， 转化率有待提高。而采用全细胞酶转化巴豆甜菜碱可以克服菌株对底物的高浓度不耐性， 如CN96117166. 9使用大肠杆菌的紫外诱变株对巴豆甜菜碱进行转化，L-肉碱产量最高达 15~20g/L，转化率为40~50%，此值还达不到工业化生产水平，产量和转化率都有待提 尚。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方 法和用途。通过基因重组技术获得具有高转化活性的大肠杆菌基因工程菌，并结合全细胞 酶转化工艺优化，大大提高L-肉碱产量，达到生物法制备L-肉碱的产量和转化率的领先水 平。
[0005] 本发明通过以下方案来实现：
[0006] -种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌将大肠杆 菌野生株BW25113基因组上编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因删除得到大 肠杆菌突变株BW Λ ac eK，选择厌氧诱导的质粒pET-A，在多克隆位点的Nde I /Kpn I酶切 位点插入caiB⑶片段，得到第一个过表达质粒pEH-caiB⑶；将caiT插入到pACY⑶的 Ndel/Xhol位点，同时将caiF插入到同一 pACYCD的Hind III/EcoR I位点，得到第二个 过表达质粒pACYCD-caiT-caiF ;将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同 时转入大肠杆菌突变株BWAaceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWAaceK/ (pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。
[0007] 一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌选择IPTG 诱导的质粒pET28a，在pET28a的插入位点Ndel/Xhol插入caiBCD片段，得到第一个过表 达质粒pET28a-caiBCD ;将caiF插入到pACYCD的Ndel/Xhol位点，同时将caiT插入到同 一 pACYCD的Hind III/EcoR I位点，得到第二个过表达质粒pACYCD-caiT-caiF ;将两个过 表达质粒pET28a-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆菌大肠杆菌BL21 (DE3)菌 株中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BL21 (DE3V(pET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-ca iF) 〇
[0008] 从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiB⑶片段，正向引物序列为：5'-GG GCATATGGATCATCTACCCATGCC-3 ' ;反向引物序列为：5' -ATTGGTACCCAACCGTGAGCTATTACG CC-3'。
[0009] 所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按以下操作步 骤进行：
[0010] 步骤一：以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，将基因组上的aceK基因删 除，得到大肠杆菌突变株BWAaceK;步骤二：从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩 增caiBCD片段，引物设计正向为：5 ' -GGGCATATGGATCATCTACCCATGCC-3 ' ；引物设计反 向为：5 ' -ATTGGTACCCAACCGTGAGCTATTACGCC-3 ' ；从大肠杆菌W3110的基因组上扩出基 因 caiF和caiT，扩增caiF的正向和反向引物序列分别为：5' -CACGCCCATATGTGTGAAGGAT ATGTTGAAAAAC-3' 和 5' -CAGCTCGAGTTAACGACGCATACTCTTTGACAA-3' ；扩增 caiT 的正向和 反向引物序列分别为：5' -GGGGAATTCATGAAGAATGAAAAGAGAAAAACGG-3' 和 5' -GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG-3' ；步骤三：选择一个厌氧启动子诱导的质粒pET-A为载体， 在多克隆位点的Ndel/Kpnl酶切位点插入caiBCD片段，得到过表达质粒pEH-caiBCD ;将 caiF和caiT分别插入到同一个质粒pACYCD的Ndel/Xhol和EcoRI/HindllI位点，得到过表 达质粒pACYCD-caiT-caiF ;步骤四：将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF 同时转入大肠杆菌突变株BWA aceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWA aceK/ (pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。
[0011] 所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按以下操作步 骤进行：
[0012] 步骤一：从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiB⑶片段，引物设计正 向为：5' -GGGCATATGGATCATCTACCCATGCC-3'（SEQ ID NO. 1);引物设计反向为：5' -ATTCTC GAGCAACCGTGAGCTATTACGCC-3'（SEQ ID NO. 9);步骤二：选择一个 IPTG 诱导启动子的质粒 pET28a为载体，在多克隆位点的Ndel/Xhol酶切位点插入caiB⑶片段，得到过表达质粒 pET28a-caiBCD ;步骤三：将过表达质粒pET-caiBCD转入大肠杆菌表达株BL21 (DE3)中，获 得基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-caiBCD;步骤四：从大肠杆菌W3110上扩出基因 caiF和 caiT，caiF 的正向和反向引物分别为：5'-CACGCCCAT ATGTGTGAAGGATATGTTGAAAAAC-3'（SE Q NO. 3)和 5' -CAGCTCGAGTTAACGACGCATACTCTTTGACAA-3'（SEQ NO. 4) ;caiT 的正向和反向 引物分别为：5' -GGGGAATTCATGAAGAATGAAAAGAGAAAAACGG-3'（SEQ NO. 5)和 5' -GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG-3'（SEQ NO. 6);步骤五：将 caiF 和 caiT 同时插入到 pACYCD 的Ndel/Xhol和EcoR I/Hind III位点，得到过表达质粒pACYCD-caiT-caiF ;步骤六：将过 表达质粒pACYCD-caiT-caiF转入大肠杆菌基因工程菌BL21 (DE3)/pET28a-caiBCD中，获 得产 L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌 BL21 (DE3) ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。
[0013] 将大肠杆菌体内编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因删除，该aceK基 因参与三羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶的翻译后调控，对巴豆甜菜碱转化为L-肉碱有抑制 作用，因此将ace K基因删除后，L-肉碱的产量有少量提高。在大肠杆菌原有基因簇表达 基础上，克隆体内转化巴豆甜菜碱生产L-肉碱的三个关键酶编码基因 caiB⑶，这三个基因 分别编码巴豆甜菜碱基-CoA:肉碱CoA转移酶（CaiB)、ATP-依赖的辅酶A连接酶（CaiC) 以及巴豆甜菜碱基-CoA水合酶（CaiD)。caiB⑶片段插入到外源质粒厌氧诱导的强启动子 的控制下游，选择Ndel/Kpnl双酶切位点插入，重组质粒再转入大肠杆菌ace K突变株体内 进行过表达。此外，将转运子编码基因 caiT和正调控子caiF在质粒pACY⑶的Hind III/ Eco