血管内皮细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞的培养，具体地，涉及一种血管内皮细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]干细胞指的是能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。从干细胞在发育中所处的阶段来看，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell) ο胚胎干细胞是一种多能干细胞(pluripotentstem cell)，可以无限增殖并分化成人体两百多种类型细胞、形成机体的组织和器官，即能分化成多种细胞和组织的潜能的干细胞。1981年Evans和Kaufman从小鼠内细胞团(inner cell mass, I CM)分离胚胎干细胞以来，ES细胞研宄成为各国科学家研宄的热点，近年来围绕干细胞定向分化成其它类型细胞的研宄如雨后春笋般出现(1981 ;Nature292 (5819): 154-6)。1998年Thomson成功分离、培养人类胚胎干细胞，为干细胞的人类医学应用提供了可能(1998 ;Science 282(5391): 1145-7)。2006年日本京都大学的山中伸弥等率先报道了 iPS细胞的研宄(2006 ；Celll26(4):663-76)，他们通过向终端分化的小鼠表皮成纤维细胞中导入四种转录因子0SKM(0Ct4，SOX2，Klf4，C-MyC)，可以诱导终端分化的细胞成干细胞状态，即iPS细胞(induced pluripotent stem cell)，此后出现了各种制造iPS细胞的技术路径。人工诱导的多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化能力、表观遗传修饰和细胞形态等其他特征，为干细胞的研宄提供了新的思路。
[0003]干细胞具有多种分化潜能，可以在体外长期保存，具有自我更新和无限增殖潜力。干细胞的这些特点为科学研宄和医学应用提供了很好的细胞来源。目前干细胞主要研宄与应用方向主要包括:1)细胞治疗，已有报道可以将干细胞定向分化成肝细胞(公告号为CN102666853A的专利)和心肌细胞(公告号为CN103602633A和CN104293730A的专利)等其他类型的细胞，为细胞治疗提供了大量的有生理功能的细胞来源；2)再生医学领域，传统再生医学如器官移植是通过供体者器官移植到受体体内，这种移植手段会产生很多问题，如免疫排斥反应和感染等。通过体外人工诱导病人自己的干细胞定向分化成成熟的具有生理功能的器官可以有效地解决这些负面效应，为再生医学提供新方法。3)药物开发，体外诱导干细胞定向分化成特定类型细胞后加入各种药物，研宄药物对特定组织或细胞的毒性，节省大量研宄成本，为临床应用提供大量数据。
[0004]血管是体内负责运输血液、氧气和营养物质等的重要通道，血管出现问题，可能造成组织和器官衰竭甚至坏死而危及生命，如血管内皮细胞损伤可以诱导高血压和冠心病等血管疾病的发生。心血管疾病是威胁人类健康的常见疾病，位于我国疾病发病率的首位。同时，科学研宄也需要大量血管，为药物对血管组织损伤实验提供材料。另外，体外人造组织器官需要血管运输营养物质为器官生长提供养分。此外，临床和再生医学领域也迫切需要各种血管组织细胞。鉴于上述情况，如何在体外得到大量的血管组织细胞显得极为重要。多能干细胞能够为我们提供大量的种子细胞，可以定向分化成血管内皮细胞(endothelialcell)和祖细胞(endothelial progenitor cell)，从而能够为修复治疗提供大量细胞、为体外构建组织模型提供血管细胞来源，也能够为药物筛选和药物毒性研宄提供很好的材料。
[0005]目前，多能干细胞的培养过程中使用的培养基中往往含有动物源成分，尤其是中血管内皮细胞祖细胞的培养，如使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞，Mouse EmbryonicFibroblast)滋养层细胞和培养基中的动物血清。虽然上述培养基可以保证干细胞及其诱导分化的细胞具有优异的自我更新能力，但是由于培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；同时可能引入动物源性污染，如支原体污染等；另外，在细胞治疗的过程中还会诱发免疫反应。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种血管内皮细胞的培养方法，该培养方法中使用的未含有动物源成分，并且该培养基能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，从而能够高效地将多能干细胞诱导分化形成血管内皮细胞，并且该血管内皮细胞形成有高度类似于人类脐带血管内皮细胞的血管状网格。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供了本发明提供了一种血管内皮细胞的培养方法，包括:
[0008]I)将多能干细胞于培养基A中诱导分化形成中内胚层前体细胞；
[0009]2)将中内胚层前体细胞于培养基B中诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞；
[0010]3)将血管内皮细胞祖细胞于培养基C中诱导分化形成血管内皮细胞；
[0011]其中，培养基A含有DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制剂；培养基B含有DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂；培养基C含有DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。
[0012]通过上述技术方案，本发明提供的培养方法中的培养基包括培养基Α、培养基B和培养基C，这三种培养基中各组分通过协同作用可以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境使得培养细胞具有优异的自我更新能力，同时该培养基中未使用动物源成分进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。在上述内容的基础上，本发明提供的方法能够有效地将人类多能干细胞诱导分化为血管内皮细胞，进而使得血管内皮细胞能够实现大规模的工业应用，并且该血管内皮细胞祖细胞形成有高度类似于人类脐带血管内皮细胞的血管状网格，进而使得该血管内皮细胞祖细胞可以在细胞治疗，体外组织构建、体外移植物构建、药物筛选和血管生物学研宄中的得以广泛应用。
[0013]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0014]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0015]图1是人类多能干细胞的形态特征图；
[0016]图2是检测例I中基于⑶31+⑶34+表征细胞Dl的形态特征图；
[0017]图3是检测例I中基于⑶31+⑶34-表征细胞El的形态特征图；
[0018]图4是人类多能干细胞的细胞系图；
[0019]图5是检测例I中人类多能干细胞诱导分化后5天⑶31和⑶34的表达检测结果图；
[0020]图6是人类脐带血管内皮细胞系图(作为阳性对照)；
[0021]图7是检测例2中细胞Dl的类血管网络生成结果图；
[0022]图8是检测例2中细胞El的类血管网络生成结果图；
[0023]图9是检测例3中细胞El与周细胞的共定位检测结果图。
【具体实施方式】
[0024]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0025]本发明提供了一种血管内皮细胞的培养方法，包括:
[0026]I)将多能干细胞于培养基A中诱导分化形成中内胚层前体细胞；
[0027]2)将中内胚层前体细胞于培养基B中诱导分化形成血管内皮细胞祖细胞；
[0028]3)将血管内皮细胞祖细胞于培养基C中诱导分化形成血管内皮细胞；
[0029]其中，培养基A含有DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制剂；培养基B含有DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子和转化生长因子β信号通路抑制剂；培养基C含有DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。
[0030]在上述培养基A中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了使得培养基A能够为培养细胞提供更加充足的营养物质和更加稳定的生存环境，优选地，在培养基A中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:1_1:4，维生素C的浓度为1_100 μ g/ml，胰岛素的浓度为l-100yg/ml，激活素A的浓度为5-100ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为1-1OOng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为1-100 μ M，砸酸钠的浓度为1-100 μ g/L，碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L。更优选地，在培养基A中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:1-1:4，维生素C的浓度为20-100 μ g/ml，胰岛素的浓度为5-50 μ g/ml，激活素A的浓度为5-50ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为l_50ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为2-40 μ M，砸酸钠的浓度为1-50 μ g/L，碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L。进一步优选地，在培养基A中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:1_1:4，维生素C的浓度为50-100 μ g/ml，胰岛素的浓度为10-30 μ g/ml，激活素A的浓度为10_30ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为2-10ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为10-30 μ M，砸酸钠的浓度为2_30 μ g/L，碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。
[0031]在上述培养基B中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了使得培养基B能够为培养细胞提供更加充足的营养物质和更加稳定的生存环境，优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:1-1:4，维生素C的浓度为1-100 μ g/ml，胰岛素的浓度为1-100^8/1111，血管内皮生长因子的浓度为5-1001^/1111，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-50 μ Μ，砸酸钠的浓度为1-100 μ g/L，碳酸氢钠的浓度为100