一种聚(1,3-丙二醇-癸二酸酯)在制备视网膜神经细胞载体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于视网膜修复领域，特别涉及一种聚（1，3-丙二醇-癸二酸酯）在制备 视网膜神经细胞载体中的应用。
【背景技术】
[0002] 老年性黄斑变性（AMD)和色素性视网膜炎（RP)是造成视神经元退化变性进而 导致视力缺陷的两个主要因素。新发展的治疗手段可将病变的视网膜神经元重建。由此 发展出多种治疗方法，比如基因治疗、生长因子治疗和小分子药物疗法。但这些治疗方法 只能延缓病变恶化，不能从根本上治疗疾病。近年来，体外培养视网膜神经细胞元，然后 移植到体内替换病变组织的治疗方法得到越来越多的关注。但是寻找一种合适的细胞生 长基质作为细胞的递送载体成为这一治疗方法突破的关键。聚（1，3-丙二醇癸二酸酯） [Poly(propylene sebacate)，PPS]是近来发展的环境友好性高分子。对其研宄才刚刚开 始，文献报道非常有限，主要是其热性质比如结晶性和熔融行为的研宄。对PPS更全面的性 质研宄缺乏，尚未见其具体应用的报道。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种聚（1，3_丙二醇-癸二酸酯）在制备视网 膜神经细胞载体中的应用，该发明中的聚（1，3-丙二醇-癸二酸酯）具有很好的生物相容 性，细胞的炎症和凋亡因子低，对视网膜神经细胞的增值具有显著的促进作用，在视网膜神 经细胞移植和视网膜神经细胞修复中具有很好的应用潜能。
[0004] 本发明的一种聚（1，3_丙二醇-癸二酸酯）在制备视网膜神经细胞载体中的应 用，视网膜祖细胞RPCs在视网膜神经细胞载体上进行增殖、分化和迀移；其中，视网膜神经 细胞载体的成分包括聚（1，3-丙二醇-癸二酸酯）PPS。
[0005] 所述PPS的分子式为
[0006] 所述PPS的分子式中η = 10-300。
[0007] 所述PPS的制备方法包括：将重结晶的癸二酸与等摩尔量的1，3-丙二醇在氮气环 境中135°C，聚合24小时，保持反应温度不变，抽真空3bar反应12-96小时，沉淀纯化，真空 干燥，即得。
[0008] 所述沉淀纯化用的试剂为乙醚。
[0009] 所述真空干燥的时间为24h。
[0010] Kou JH等报道了 PLGA在大脑中具有高度的生物相容性，在PPS的体内生物相容性 实验中，用PLGA作为参比聚合物。IL-6和MCP-I与炎症性眼内疾病有很大关系。RPCs在 PPS支架上生长实验结果表明，相对于PLGA，PPS对IL-6有很大的抑制作用，对MCP-I有轻 微的抑制作用。实验结果表明，和参比材料相比，在PPS上生长的RPCs没有明显胱天蛋白 酶-3表达，另外，PPS上生长的细胞粘附分子钙蛋白4有很明显的增加，也就是说，PPS是 有利于细胞健康生长的。这些数据表明PPS对RPCs具有优良的体内生物相容性，这对以后 细胞替代法作为细胞载体非常重要。另外，良好机械性质的载体对细胞移植有很大的帮助。 视网膜组织的弹性模量为0.1 MPa，最大形变率为84%，PLGA的弹性模量为I. 4-2. 8GPa，最 大形变率为8. 7%。PPS弹性模量为6. 45± I. 93MPa，数据表明，和PLGA相比，PPS的机械性 质和视网膜组织的更接近。
[0011] 从视网膜上分离的RPCs数量很少，因此在体外实验中其增殖能力受到很大的限 制。然而，必须得到大量的RPCs以使细胞替代移植成功，因此在细胞移植前改善RPCs的培 养方法以获得足够的细胞是最重要的。之前的研宄表明，PLGA有很好的促进RPCs增殖的能 力。本发明将RPCs在PPS/PLGA上进行培养进行研宄，结果表明，在PPS材料上生长的RPCs 中Ki-67(细胞增殖的标志）的表达比PLGA材料要明显高很多，通过CCK8分析的数据，再 次表明PPS对RPCs有很好的促进其分化的能力。这为以后细胞移植疗法得到足够的细胞 起到很大作用。
[0012] 本发明通过一系列实验对视网膜祖细胞（Retinal progenitor cells, RPCs)在 PPS上的增殖、分化、迀移等各种细胞行为进行了研宄。体外细胞实验数据显示PPS支架具 有良好的生物相容性，细胞的炎症和凋亡因子表达低。体外细胞增殖试验（ki-67, BrdU和 CCK8)表明PPS对视网膜神经细胞的增殖具有显著的促进作用。因此，PPS作为一种功能高 分子材料在视网膜神经细胞移植中有着良好的应用潜能。
[0013] 有益效果
[0014] 本发明中的聚（1，3-丙二醇-癸二酸酯）具有很好的生物相容性，细胞的炎症和 凋亡因子低，对视网膜神经细胞的增值具有显著的促进作用，在视网膜神经细胞移植和视 网膜神经细胞修复中具有很好的应用潜能。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例1中PPS的1HNMR谱图；
[0016] 图2为实施例1中PPS的FTIR谱图；
[0017] 图3为实施例1中对PPS进行的接触角实验图；
[0018] 图4为实施例1中PPS的拉伸应力应变图；
[0019] 图5为实施例1中PPS对RPCs的细胞毒性的检测结果；其中，A为在增殖条件下， 炎症因子（MCP-I)的表达和细胞在支架上的生长通过qPCR分析；B为RPCs在PPS和PLGA 支架以及对照组上培养细胞的凋亡因子（Caspase-3)表达；C为增殖条件下培养三天，测量 RPC细胞粘附因子cadherin 4的表达；D为RPC细胞在PPS和PLGA支架上培养，通过乳酸 脱氢酶释放试验（LDH assays)与对照组的毒性比较；
[0020] 图6为实施例1中RPCs在材料支架上增殖的能力；其中，A为在增殖条件下，培养 在PPS/PLGA和对照组上的RPCs培养1，3, 5天的GFP+的荧光显微照片；B为细胞的增殖能 力用CCK8分析表征结果；C为Western blot分析种植在RPCs支架上的巢蛋白的表达水平； 比例尺为100 ym ;
[0021] 图7为实施例1中对培养在不同支架上的RPCs进行免疫染色和qPCR分析结果； 其中，A-L为增值条件下细胞培养3天，分别对接种在PPS，PLGA和对照组进行抗5-溴脱氧 尿苷（BrdU)，Ki-67 (细胞增殖的标志）和波形蛋白（视网膜祖细胞的标志）的抗体免疫标 记；(M-O)为qPCR分析结果；比例尺为100 μ m，*p〈0. 05被认为有显著差异。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0023] 实施例1
[0024] (I)PPS 的制备
[0025] 重结晶过的癸二酸（J&K，98 % )和等摩尔量的1，3-丙二醇（Energy Chemical, 99% )在135°C下，氮气环境中预聚合24小时，然后保持反应温度不变，对反应体 系抽真空（3bar)反应57小时，将反应产物在乙醚中沉淀纯化，并对纯化之后的产物在真空 下干燥24小时，得到白色固体PPS。
[0026] (2) RPCs的分尚和培养
[0027] 本试验所用动物均依照视觉与眼科协会动物使用标准，并严格按照Schepens眼 科研宄所动物饲养使用委员会审批过的程序进行。视网膜祖细胞从出生后1天对绿色荧 光蛋白呈阳性（GFP+)的转基因 C57BL/6小鼠身上获得，合并视网膜切碎并经过几个周期 0. 1%的I型胶原蛋白酶消化进行分离。分离的RPCs用孔径为100微米的尼龙网进行过 滤，在转速为800rpm下离心4min，将细胞在含有DMEM/F12 (Invitrogen)，1 %队神经供给 物（Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺（Invitrogen), 100U/ml 青霉素-链霉素（Invitrogen), 和20ng/ml表皮生长因子（EGF，Invitrogen)的培养液中进行培养。将细胞种植在培养皿中 并每隔3-4天传代一次。为了对细胞的分化情况进行分析，将增殖培养液用分化培养液替 代，将其中表皮生长因子（EGF)除去，并加入10%的胎牛血清（Invitrogen)。用于细胞培养 的聚合物样品涂膜于聚苯乙稀组织培养板（tissue culture-treated polystyrene, TCPS) 上。将80 μ 1浓度为lg/1的PPS/PLGA (对照材料）的甲醇溶液加入到12孔聚苯乙烯组织 培养板（tissue culture-treated polystyrene，TCPS)中（80μ1/孔）。待甲醇挥发后， 置于真空中抽吸12小时进一步去除溶剂获得涂膜的组织培养板。将组织培养板置于紫外 光下30min进行杀毒，然后用Iml磷酸盐缓冲液清洗三次，再用Iml培养液润洗，接着种上 RPCs，进行培养。
[0028] (3) PPS/PLGA对RPCs的增殖和分化
[0029] RPCs在PPS/PLGA的生长情况分别在培养第1，3,5天时用标准落射荧光显微 镜（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)进行拍照观察，其增殖情况通过CCK-8试剂盒 (cell counting kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japan)进行进一步检测。细胞培养在 96 孔板， 种植浓度为IX 104个细胞/孔，CCK-8溶液在第一天，第二天，第三天直接加入孔板中，在 37°C继续培养4h后，用ELISA读板器（ELX800, BioTeK，USA)测量其在450nm处的吸光度， 细胞活性用A450值进行表示。为了表征在分化条件下，生长在PPS上的RPCs细胞形态，在 第三天的时候用标准落射焚光显微镜（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)放大10倍和 20倍进行拍摄。
[0030] (4)蛋白质印迹分析
[0031] 使用 RIPA (Radioimmunoprecipitation assay)裂解液（Thermo Fisher Scientific)提取蛋白质溶解产物，之后用BCA蛋白浓度测定试剂盒 (Pierce, Rockford, IL)测定蛋白质的浓度。利用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝 胶电泳（SDS-PAGE)将蛋白质分离，