性和特异性高。根据研宄的不同要求和目的， CFSE可分别标记靶细胞和效应细胞，分析靶细胞对效应细胞的细胞毒作用和分析效应细胞 对靶细胞的细胞毒作用。
[0014] 本发明是采用如下技术方案实现的： 一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，包括如下步骤： (1)、NK细胞的采集分离： 1. 1、外周血采集：采集实体肿瘤患者外周血40~60ml。
[0015] 1.2、NK 细胞分离： I. 2a、将采集的外周血装入离心管中，离心条件：离心力500g，离心时间lOmin。吸出血 浆装入另一只离心管中于56°C水浴锅中灭活30min后离心，离心条件：离心力850g，离心时 间lOmin。离心后取上清装入离心管中放入4°C冰箱中备用。
[0016] I. 2b、将沉淀的红细胞层与生理盐水按照1:1混合，缓慢加入装有分离液的离心 管中，在移动或装入离心机时动作要轻柔，防止血细胞层与分离液层混合，离心条件：离心 力700g，离心时间15min，离心温度20~25°C。将上述分离后的白膜层移至另一离心管中，再 加入同等量生理盐水，洗涤两次，第一次洗涤时离心条件：离心力750g，离心时间5min ;第 二次洗绦时离心条件：离心力500g，离心时间5min。
[0017] (2)、NK细胞活化扩增： 2. 1、取⑶16mAb (克隆号：3G8)加入装有PBS的培养瓶中，使抗体终浓度为1-lOug/mL (最佳浓度为lug/mL)，将培养瓶放于4°C冰箱中，包被抗体至少三天以上，用PBS洗两遍备 用。
[0018] 2. 2、将步骤（1)分离获得的细胞洗涤后计数，加入新鲜培养液，该新鲜培养液为临 床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血浆，加入培养新鲜培养 液的体积根据细胞浓度而定，细胞浓度为lXl〇6/mL~2X106/mL ;转入已包被抗体的培养瓶 中并加入IFN-γ ; IFN-γ浓度为100~1000U/mL，最适浓度为1000U/mL，IL-2浓度为1000U/ mL~2000U/mL，最适浓度为 2000U/mL。
[0019] 2. 3、NK细胞培养扩增 2. 3a、培养第3天观察细胞状态，加入等倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无 血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血清，新鲜培养液中IL-2的浓度 为 1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为 2000U/mL。
[0020] 2. 3b、第5天观察细胞状态，加入2倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2 的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为 2000U/mL〇
[0021] 2. 3c、之后，隔天加入等倍体积的新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级 无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为2000U/mL。
[0022] 培养至第17或18天，获得处于对数生长期的NK细胞。
[0023] 在实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增的基础上，进行细胞杀伤活性检测 方法使用三种荧光染料，分别是CFSE、PE-Annexin-V、7-AAD，CFSE用于标记靶细胞， PE-Annexin-V用于检测早期凋亡细胞，7-AAD用于检测中晚期凋亡细胞。
[0024] (3)、NK细胞杀伤活性检测： 3. UCFSE标记靶细胞： 收集生长状况良好的肿瘤细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心 5min。洗涤2次，台盼蓝计数并用PBS缓冲液重悬细胞； 将预温好的CFSE-PBS液加入细胞团中，其中CFSE终浓度为2umol/L ;37 °C放置 5~IOmin ; 加入含10%已灭活胎牛血清（FBS)的1640培养基终止反应； 离心细胞，加入含10% FBS的1640培养基，37°C放置lOmin，PBS洗涤2次，最后用含 10% FBS的1640培养基重悬细胞。
[0025] 3. 2、收集效应细胞及制备效靶比梯度： 收集步骤（2)中对数期生长的效应细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室 温离心5min。洗涤2次，台盼蓝计数并用含10% FBS的1640培养基重悬细胞。
[0026] 3. 3、效靶细胞共培养： 将处理好的效应细胞与标记好的靶细胞按效靶比10:1~50:1，加入24孔无菌细胞培养 板中； 并设只加靶细胞和效应细胞作为对照孔，用于检测靶细胞和效应细胞的自发死亡率； 用含10% FBS的1640培养基补齐每孔体积； 将细胞培养板轻轻混匀，离心条件为离心力300g室温离心3min，以使效应细胞和靶细 胞紧密接触； 5% C02、37°C培养箱孵育4h。
[0027] 3. 4、流式细胞仪分析细胞杀伤率： 将细胞收集于流式管中，台盼蓝计数，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温 离心5min ; 加入PBS缓冲液和PE-Annectin-V，避光孵育IOmin ; 加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min ; 离心后加入PBS缓冲液和7-AAD，4h之内流式细胞仪检测；同时设定阴性对照管：未标 记CFSE管、不加抗体管、只加 PE-Annectin-V管、只加7-AAD管； 所有标本使用FACSCalibur仪检测，用CellQuest获取和分析数据。
[0028] 计算公式：杀伤细胞毒性（％)=(靶细胞死亡率-靶细胞自发死亡率）/ (100-靶 细胞自发死亡率）X 100%。
[0029] 与现有技术相比，具有的优点如下： 1、本发明方法只需要采集实体肿瘤患者外周血40~60ml，经过体外一系列刺激因子的 活化和扩增培养后，NK细胞的纯度及数量能够达到临床治疗的水平，无需特殊的仪器设备， 也不需要特殊的处理过程，操作简便，降低了操作过程中污染发生的机率。培养过程中采用 一次性耗材、无血清培养基和临床级药品重组人IL-2和重组人IFN- γ，增加了 NK细胞临床 应用过程中的安全性。
[0030] 2、本发明方法是研宄小组将不同刺激因子和其组合对NK细胞体外扩增效果进行 大量筛选而总结出的最佳方案。若在培养过程中增加一种细胞因子就会增加一部分不可控 因素，若缺乏某种细胞因子，有可能细胞的数量和纯度达不到要求，因此目前本发明方法的 刺激因子组合及其所用剂量为最佳组合和最佳刺激剂量。
[0031] 3、流式细胞术目前已广泛应用于免疫学研宄，其可检测到单细胞水平，因此较其 他检测方法更为准确。本发明方法中NK细胞细胞毒活性的检测方法是将流式细胞仪检测 技术基础上，联合CFSE、Annexin-V与7-AAD三种荧光染料，根据荧光染料的特性和细胞凋 亡过程的细胞膜和细胞核的变化特点的检测技术，采用PE-Annectin-V和7-AAD联合染色， PE-Annectin-V会结合发生早期凋亡细胞的膜磷脂酰丝氨酸，7-AAD与核酸结合；此技术方 法不仅能从混合细胞中特异性地区分靶细胞和效应细胞，而且能检测到早期凋亡靶细胞， 即CFSE+Annexin-VI-AAT单阳性细胞为活性正常靶细胞，CFSE +Annexin-V+7-AAD^X阳性 细胞为凋亡早期靶细胞，CFSE+Annexin-V+7-AAD+三阳性细胞为凋亡晚期或已经死亡有完整 细胞结构的靶细胞；由于流式细胞术分析细胞的优势，当靶细胞数目少，其他方法无法检测 时，亦可采用此方法进行检测；本发明方法中采用存活的靶细胞的比较和计算(详见计算公 式)，扣除了在细胞培养期间发生自然凋亡的靶细胞的信号干扰。
[0032] 本发明设计合理，在实验过程中不断改变思路和改进方法，经过不断试验和验证， 利用本发明方法能够从实体瘤患者自体外周血中分离获得高活性的淋巴细胞群，然后体外 经过一系列细胞因子的刺激，NK细胞（CD3_CD56+)得到活化和大量扩增，达到了临床治疗肿 瘤水平。
[0033] -种基于流式细胞术的免疫细胞介导的细胞毒作用检测方法--CFSE/ Annexin-V/7-AAD三联染色法。NK细胞的细胞毒活性检测方法不仅能在免疫细胞和肿瘤细 胞的混合细胞群中特异性地分析效应细胞对靶细胞的细胞毒作用，并且能分析早期凋亡和 晚期凋亡靶细胞，避免了效应细胞和靶细胞的自然凋亡与效应细胞和靶细胞混合培养过程 中靶细胞作用于效应细胞而导致的效应细胞死亡对检测结果的干扰。其方法简便易行、灵 敏度高，可以在单个细胞水平检测细胞的细胞毒活性，在过继免疫细胞治疗肿瘤的临床应 用前基础研宄和临床应用中质控方面具有重要意义。
【附图说明】
[0034] 图1表示随着培养天数变化两组细胞中NK细胞（⑶3TD56+)比例变化趋势图。
[0035] 图2表示随着培养天数的变化两组细胞总数趋势图。
[0036] 图3表示培养不同天数检测两组细胞中NK细胞（⑶3TD56+)的流式图。
[0037] 图4a表示E组中外周血NK细胞IFN- γ分泌功能流式细胞图。
[0038] 图4b表示E组中培养17天NK细胞IFN- γ分泌功能流式细胞图。
[0039] 图5a表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析E组细胞与Κ562细胞效靶比为 10:1、20:1、40:1时的杀伤结果。
[0040] 图5b表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析C组细胞与K562细胞效靶比为 10:1、20:1、40:1时的杀伤结果。
[0041] 图5c表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析单纯效应细胞自然凋亡结果。