一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 癌症是人类健康的三大杀手之一，每年因恶性肿瘤导致死亡的人数有逐年增加的 趋势。现有的肿瘤疾病的治疗中，通常有化疗、放疗和手术治疗几种方式。由于肿瘤手术 有其局限性，化学疗法多与手术、放疗等联合使用，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。使用单一 药物化疗通常都不能取得理想的治疗效果，因此肿瘤的治疗通常采用多种化疗药物联合应 用。然而，多药联合治疗时，多药耐药是对化疗药物疗效及病人康复的一大障碍。为了研宄 不同癌症多药耐药的机制，就必须建立多药耐药的模型。由此，建立一种多药耐药的细胞模 型或动物模型显得异常重要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，旨在解决肿瘤细 胞多药耐药问题。
[0004] 本发明是这样实现的，一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0005] 提供肿瘤细胞，并进行培养；
[0006] 使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，得到盐酸米托蒽醌诱导耐药细 胞系；
[0007] 使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARPl基因。
[0008] 本发明提供的一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，利用盐酸米托蒽醌诱导癌 细胞形成盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系，并在所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的基础上 采用RNAi技术沉默多药耐药的关键基因 PARP1，建立了多药耐药肿瘤细胞模型，从而抑制 PARPl对DNA的修复，提高肿瘤细胞对药物和放化疗的敏感性。
【具体实施方式】
[0009] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释 本发明，并不用于限定本发明。
[0010] 本发明实施例提供了一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0011] SOL提供肿瘤细胞，并进行培养；
[0012] S02.使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，得到盐酸米托蒽醌诱导耐 药细胞系；
[0013] S03.使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARPl基因。
[0014] 具体的，上述步骤SOl中，所述肿瘤细胞的选用不受限制，任何肿瘤细胞均可以用 于本发明实施例中用作构建多药耐药肿瘤细胞模型。优选的，本发明实施例可采用MCF7细 胞（人乳腺癌细胞）来构建多药耐药肿瘤细胞模型。
[0015] 上述步骤S02中，使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，可以得到盐 酸米托蒽醌诱导耐药细胞系。为了获得效果诱导效果较好的盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞 系，作为优选实施例，使用终浓度为〇. 005-0. 04 μM的所述盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞 进行染毒，诱导耐药。进一步的，优选使用终浓度为〇. 02 μ M的所述盐酸米托蒽醌对所述肿 瘤细胞进行染毒，诱导耐药。
[0016] 为了比较药物诱导的效果，可选用不同浓度的盐酸米托蒽醌平行对照组对所述肿 瘤细胞进行药物诱导，同时设立野生型空白对照组。作为具体实施例，将盐酸米托蒽醌粉 末配置成5 μ mol/L的母液，进行稀释处理分别得到终浓度为0. 005 μ M、0. 01 μ Μ、0. 02 μ Μ、 0. 04 μ M的盐酸米托蒽醌平行组。各平行组分别选用5 μ L、10 μ L、20 μ L、40 μ L体积的米托 蒽醌依次对所述肿瘤细胞如MCF-7细胞进行染毒，诱导耐药。24h换液一次，并继续染毒； 传代时停药，贴壁后再染毒。持续染毒30天后，对每个完成诱导阶段的细胞，在倒置显微镜 下观察细胞形态变化，拍照，并于液氮中冻存保种备用。
[0017] 本发明实施例中，为了检测所述盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞的药物诱导效果， 可对获得的肿瘤细胞进行耐药性检查。作为具体实施例，采用流式细胞术检测经所述盐酸 米托蒽醌诱导后的肿瘤细胞的耐药性，具体操作如下：
[0018] Q01.将所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系停药培养两周后，将所述野生型空白对 照组及各所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系分别接种到六孔板上；
[0019] Q02.待细胞融合到70-80%时，加入终浓度为3 μΜ的带荧光的米托蒽醌，放入培 养箱中培养l_4h，更优选为2h，为了防止所述米托蒽醌所带的荧光淬灭，进行避光处理；
[0020] Q03.使用PBS洗涤上述培养的细胞后，换液，继续培养Ih，避光处理；
[0021] Q04.采用胰酶消化处理后收集细胞，PBS悬浮，吹打成单个细胞，避光；
[0022] Q05.上机，检测。
[0023] 作为本发明另一个具体实施例，可以采用Western blotting检测盐酸米托蒽醌诱 导耐药细胞系，具体操作可参照如下：
[0024] WOL所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞总蛋白的提取：倒掉培养液，用预冷的PBS 漂洗两次，用移液器枪吸干净残留的PBS。将处理后的样品置于冰上，加入细胞裂解液，裂解 处理30min。所述裂解处理结束后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，用枪吸取裂解 液移到离心管中进行离心处理。作为具体优选实施例，所述离心处理在4°C下12000rpm离 心25min。将离心后的上清液分装后置于-20°C条件下保存。
[0025] W02. SDS-PAGE :配制10 %的分离胶，5 %的浓缩胶，取出所述上清液样品至离心管 中，加入5XSDS缓冲液至终浓度为IX，混匀后加热处理使蛋白质变性。作为具体实施例， 可采用加热器98°C条件下煮5min。将所述分离胶、浓缩胶连同胶板一起放入电泳槽，加入 IX电泳缓冲液，电泳缓冲液加至漫过加样孔后开始上样。上样量在15-20 μ L，再在胶的两 侧分别加入3 μ L的蛋白maker。所述电泳的条件优选为：浓缩胶80V，30min ;分离胶120V， lh，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。
[0026] W03.转膜：电泳结束后，剪2张与分离胶大小相同的滤纸和1张硝酸纤维素膜， PVDF硝酸纤维膜先用甲醇浸泡Imin左右，再放入半干转膜浸泡5min。滤纸放入半干转膜 液里浸泡。自下而上依次叠放滤纸、膜、凝胶、滤纸（3层），避免产生气泡。电转移时电流一 块胶电流38mA转印2h。
[0027] W04.封闭：将转移后的PVDF膜放入封闭液中，常温下，2h，或4°C封闭过夜。
[0028] W05.免疫反应：封闭结束后，剪取所需条带，加入封闭液，孵一抗内参GAPDH以 1:2000比例稀释，MBDs以1:300稀释。加入一抗后4°C孵育过夜。一抗过夜后，加 TBST洗 膜三次，每次l〇min。孵二抗，内参GAPDH与封闭液1:3000稀释比例，加入封闭液，取所述二 抗，放在摇床上Ih孵育。二抗孵育结束后，同样加 TBST洗膜三次，每次lOmin。
[0029] W06.化学发光，显影：按照ECL试剂盒说明书，将化学发光剂的A液和B液等量混 合。把洗好的条带现在滤纸上过一下，吸取掉过多的液体，再按方向平放在板上，防止产生 气泡，再用发光液覆盖条带，并左右混匀，开始显影。
[0030] 经过上述步骤S02所述盐酸米托蒽醌诱导后，耐药细胞中存在大量活化状态 PARP-I，所述PARP-I可启动DNA修复功能，降低肿瘤细胞对药物和放化疗的敏感性。有鉴 于此，本发明实施例步骤S03中，使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARPl 基因，从而降低PARP-I的活度，抑制DNA修复功能，进而提高肿瘤细胞对多药放化疗的敏感 性。
[0031] 具体的，上述步骤S03使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARPl 基因包括以下步骤：
[0032] S031.设计合成 shRNA ;
[0033] S032.使用shRNA核苷酸链进行慢病毒包装；
[0034] S033.使用所述慢病毒感染所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系。
[0035] 进一步的，本发明实施例上述步骤S031中，shRNA序列的设计，是本发明实施例的 重点，关系到所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系进一步产生多药耐药性的成败因素。为了 高效地产生RNAi效应，抑制PARPl基因表达，在所述使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导 耐药细胞系的PARPl基因的步骤中，使用shRNAl、shRNA2、shRNA3三种shRNA核苷酸链进行 慢病毒包装，感染所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系。本发明实施例通过对PARPl靶mRNA 序列二级结构的研宄，获取3条19nt靶序列。在此基础上，针对3条19nt靶序列，设计合 成了相应的shRNA。作为优选实施例，所述shRNAl、shRNA2、shRNA3核苷酸链序列包含六个 区域，分别为：BamH I酶切位点、19nt靶核苷酸序列、茎环结构（TTCAAGAGA)、靶序列互补序 列、RNA Poly III聚合酶转录中止位点（TTTTTT)和EcoR I酶切位点。该优选设计的shRNA， 可高效地产生RNAi效应，从而有效抑制PARPl基因表达，降低PARPl活度，进而达到抑制 DNA修复功能、并提高肿瘤细胞对多药放化疗敏感性的目的。作为本发明对照，同时设计了 一对对照序列siRNAc，并根据对照序列siRNAc设计合成了 shRNAc。
[0036] 作为具体优选实施例，所述shRNAl、shRNA2、shRNA3和shRNAc核苷酸链的序列分 别为：
[0037] shRNAl Top ：
[0038] 5 ' -gatccGCAACAAACTGGAACAGATTTCAAGAGAATCTGTTCCAGTTTGTTGCTTTTTTACGCG Tg-3'，
[0039] shRNAl Bottom:
[0040] 5 ' -aattcACGCGTAAAAAAGCAACAAACTGGAACAGATTCTCTTGAAATCTGTTCCAGTTTGTTG Cg-3' ；
[0041] shRNA2 Top ：
[0042] 5 ' -gatccGCAACAAACTGGAACAGATTTCAAGAGAATCTGTTCCAGTTTGTTGCTTTTTTACGCG Tg-3'，
[0043] shRNA2 Bottom ：
[0044] 5 ' -aattcACGCGTAAAAAAGCAACAAACTGGAACAGATTCTCTTGAAATCTGTTCCAGTTTGTTG Cg-3' ；
[0045] shRNA3 Top ：
[0046] 5 ' -gatccGCGAGTACATTGTCTATGATTTCAAGAGAATCATAGACAATGTACTCGTTTTTTACGCG Tg-3'，
[0047] shRNA3 Bottom ：
[0048] 5 ' -aattcACGCGTAAAAAACGAGTACATTGTCTATGATTCTCTTGAAATCATAGACAATGTACTCG Cg-3' ；
[0049] shRNAc Top ：
[0050] 5' -ccggtGCTTCGACATTTAACCAATTTCAAGAGAATTGGTTAAATGTCGAAGCTTTTTTg-3'，
[0051] shRNAc Bottom ：
[0052] 5' -aattcAAAAAAGCTTCGACATTTAACCAATTCTCTTGAAATTGGTTAAATGTCGAAGCa-3'。
[0053] 该优选的所述shRNAl、shRNA2、shRNA3核苷酸链序列，用于后续慢病毒包装并转 染所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系后，可高效产生RNAi效应，从而有效抑制PARPl基因 表达，降低PAR