一种牛传染性鼻气管炎病毒ibrv-jn03分离株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-JN03分离 株及其应用。
【背景技术】
[0002] 牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引 起的牛传染性鼻气管炎，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上呈多种表现类型，特 别是该病能引起免疫抑制，继发细菌感染并导致更严重的呼吸道疾病。目前，此病在世界范 围内广泛流行，且该病严重影响着国际牛业生产贸易，已被世界动物卫生组织（OIE)列为B 类传播性疾病。我国于20世纪70年代末从新西兰进口的奶牛中检测到IBRV，由于没有很 好的免疫防护措施，随后我国多省份的牛群中均有此病毒感染，发病率为10%~90%，对 牛群的肥育、产奶和繁殖影响极大，给牛场造成巨大的经济损失。
[0003] 目前国外对该传染病的防控以疫苗免疫接种为主，其中灭活疫苗因在使用过程中 具有较好的安全性，在种公牛、母牛和经济价值高的奶牛群中得到广泛应用，对牛传染性鼻 气管炎的流行起到很好的控制作用。然而，我国尚无相关疫苗产品，并且农业部尚未许可国 外IBRV疫苗进入中国市场，更重要的是，随着IBRV的变异，即使允许国外疫苗进口，其种毒 对国内流行株的保护力也较差。因此，迫切需要分离流行株，筛选免疫原性强的IBRV典型 代表毒株，研制疫苗来预防该病的发生，减少其对养牛业造成的损失。为解决这一难题，我 们对我国不同区域的流行毒株进行分离、筛选，获得了合适的疫苗候选毒株，使牛传染性鼻 气管炎的防控更具有针对性和有效性，在牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、弱毒疫苗及活载体 疫苗的应用研宄方面具有重要的价值。同时，本发明为牛传染性鼻气管炎诊断试剂的研发 奠定了基础。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一株牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV-JN03)分离株，该病毒保藏于北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10396,保藏日期2015年2月2日，分类命名：牛 传染性鼻气管炎病毒infectious bovine rhinotracheitis virus。本发明的目的是提供 一株牛传染性鼻气管炎病毒株，所提供的毒株的毒价为8. 75X 108_5TCID5cZmL，符合疫苗生 产抗原量高的要求。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下方案：
[0006] -株牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-JN03分离株，其特征在于，系从牛传染性鼻气 管炎流行地区分离获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 CGMCC No. 10396。
[0007] 优选的是，包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0008] 本发明还提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-JN03分离株的分离方法，包括 如下步骤：
[0009] a.采集发病牛样本，处理后接种MDBK细胞，分离获得致细胞病变毒株；
[0010] b.以IBR-F和IBR-R为引物，用PCR方法进行检测扩增，分离毒株中扩增出传染性 牛鼻气管炎病毒特异性片段。
[0011] C.将分离毒株加入MDBK细胞悬液，采用Reed-Muench法计算分离毒株的滴度；
[0012] d.各分离毒株免疫原性比较分析：制备灭活抗原，免疫小鼠和兔子，产生较高的 抗体水平，筛选出免疫原性最好，即得。
[0013] 上述的牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-JN03分离株在制备牛传染性鼻气管炎疫苗 中的应用，所述牛传染性鼻气管炎疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、基因 工程疫苗或DNA疫苗。
[0014] 上述的牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-JN03分离株在制备牛传染性鼻气管炎诊断 试剂中的应用，其特征在于：所述牛传染性鼻气管炎病毒与致病性病原体抗原、抗体以及核 酸等检测相关的试剂。
[0015] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种鉴定并筛选IBRV的方法，包括以下步 骤：（1)病毒的分离和鉴定：采发病牛鼻腔分泌物、牛腹泻粪便样本、发病牛组织（肺、肝、 脾、淋巴结）样本，经处理后，将处理液接种MDBK细胞，分离获得6株致细胞病变毒株，命名 为 IBRV-SD1、IBRV-JN03、IBRV-LY10707、IBRV-LY9038、IBRV-JNDN 和 IBRV-3029。以 IBR-F 和IBR-R(SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2)为引物，用PCR方法进行检测，所分离毒株均扩增 出四1^特异性片段。以181^0?和181^〇?为引物，扩增8(：基因彼0 10勵.4)并进行 基因进化树分型分析，结果表明，上述所分离毒株均属于BHV1. i型。将分离病毒株各做10倍 系列稀释，接种MDBK细胞单层的6孔细胞培养板，在低熔点琼脂糖中形成蚀斑，进行蚀斑纯 化。分别提取细胞培养病毒的RNA，反转录成cDNA后，应用本实验室建立的RT-PCR检测方 法，对牛病毒性腹泻病毒（BVDV)、牛肠道病毒（BEV)、牛轮状病毒（BRV)、牛冠状病毒（BcoV) 进行外源病毒检测，均为阴性。所分离病毒株负染后，电镜观察，呈典型的疱瘆病毒粒子形 态，有囊膜。将分离毒株加入MDBK细胞悬液，采用Reed-Muench法计算分离毒株的TCID5Q。 结果显示，6株分离毒株的滴度在7. 35X IO5 5~8. 75X 10 8 5TCID5Q/mL。
[0016] (2)分离毒株免疫原性比较分析：对所分离纯化且病毒滴度为107_°~10 8_ 5TCID5tl/ mL的2株IBRV进行免疫原性比较研宄，在37°C下，分离毒株经0. 2%。的甲醛灭活处理36h， 制备氢氧化铝佐剂疫苗，相同剂量的病毒灭活液各接种10只小鼠和5只兔，定期采血，应用 ELISA方法测定病毒产生的抗体水平，筛选出免疫原性最好的IBRV-JN03毒株。
[0017] 在本发明第三方面，本发明提出了一种牛传染性鼻气管炎灭活疫苗的研制方法。 将分离纯化的IBRV-JN03病毒进行大量培养，上清液加入0. 2%。甲醛于37°C灭活24h，灭活 完成后进行无菌检验，然后将病毒液与氢氧化铝佐剂4:1充分混合，制成灭活疫苗。
[0018] 另外，本发明提出了一株IBRV在诊断和预防牛传染性鼻气管炎中的应用。根据本 发明实施例，筛选出的IBRV临床分离株具有较高的滴度，且具有很好的免疫原性。以该病 毒为基础制备诊断抗原、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、活载体疫苗及弱毒疫苗，对牛诊断和 免疫有很强的针对性，具有广阔的市场应用前景。
【附图说明】
[0019] 图I. IBRV-JN03病毒株致MDBK细胞病变。其中，A :产生细胞病变的MDBK细胞； B :正常MDBK细胞。
[0020] 图 2 分离病毒株PCR检测。其中，I :IBRV-SD1 ;2 :IBRV-JN03 ;3 :IBRV-LY10707 ;4 : IBRV-LY9038 ;5 :IBRV-JNDN ;6 :IBRV-3029 ;6 :分离的病毒；7 :阴性对照；8 :阳性对照；M : DL2000DNA Marker，由上到下依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0021] 图3 IBRV-JN03病毒株特异性、纯净性检测。I :BVDV阳性对照；2 :BVDV阴性对照； 3 :IBRV-JN03 BVDV 检测；4 :BcoV 阳性对照；5 :BcoV 阴性对照；6 :IBRV-JN03 BcoV 检测；7 : BRV阳性对照；8 :BRV阴性对照；9 :IBRV-JN03 BRV检测；10 :BEV阳性对照；11 :BEV阴性对 照；12 :IBRV-JN03 BEV 检测；13 :IBRV-JN03 IBRV 检测；14 :IBRV 阴性对照。M :DL1000DNA Marker，由上到下依次为 1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
[0022] 图4 IBRV粒子电镜检测。可见有囊膜、呈典型的疱瘆病毒粒子形态。
[0023] 图5利用IBRV全病毒间接ELISA方法对病毒的免疫原性分析。A :小鼠的免疫抗 体分析；B :兔的免疫抗体分析。
[0024] 图6利用IBRV gB竞争阻断ELISA方法进行犊牛免疫抗体检测。％ IN(抑制率） 值等于或大于35为阳性。
[0025] 图7犊牛免