茄子甘露糖焦磷酸化酶SmGMP蛋白及其编码基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及茄子抗坏血酸合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子 甘露糖焦磷酸化酶SmGMP蛋白及其编码基因，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 抗坏血酸是植物体内最重要的抗氧化物质之一，它可以直接清除植物在逆境或正 常代谢中产生的活性氧。其次，抗坏血酸能够维持另一种重要的抗氧化剂维生素 E处于还 原状态，并通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环间接清除H2O2，从而保护植物免于氧化胁迫的伤 害。
[0003] 目前为止，植物中抗坏血酸的生物合成被认为有4种途径，其中受公众认可的是 L-半乳糖途径。GMP (GDP-D-mannose pyrophosphorylase)，又称为 VTC1，是 L-半乳糖途径 的第一个酶，它催化甘露糖-1-磷酸转化为GDP-D-甘露糖。对拟南芥抗坏血酸缺失突变体 vtcl的研宄表明，该突变体与野生型相比，GMP活性下降，在该突变体中转入GMP基因能够 使突变体抗坏血酸的含量恢复到野生型。在马铃薯中利用反义抑制技术降低GMP的酶活， 转基因马铃薯移栽大田后叶脉和茎上出现深色斑点。在抗坏血酸含量降低最多的系中，植 株地上部分在3个月后就枯萎死亡，而野生型马铃薯未出现衰老现象。
[0004] 目前已从很多植物中克隆得到GMP基因，如拟南芥、大豆、猕猴桃、番茄等。茄子是 重要的蔬菜作物，但其因为缺少基因组相关信息，导致相关研宄比较滞后。目前，未有任何 与茄子GMP基因及其编码蛋白的相关文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于填补茄子GMP蛋白及其编码基因的空白。本发明提供了一种茄 子GMP的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmGMP基因在不同组织器官 及低温下的表达模式。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种具有茄子甘露糖焦磷酸化酶（GMP)活性的蛋白质，所 述蛋白质包括：
[0008] (a)由如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄 子甘露糖焦磷酸化酶（GMP)活性的由（a)衍生的蛋白质；
[0010] 该蛋白质在茄子不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
[0011] 优选地，所述蛋白质包括SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列经过1~50个氨基酸的缺 失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0012] 优选地，所述蛋白质为SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被性质相 似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0013] 第二方面，本发明提供了一种编码所述具有茄子甘露糖焦磷酸化酶（GMP)活性的 蛋白质的基因的核酸序列，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 优选的，所述基因的核酸序列包括：
[0015] (a)如SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的碱基序列；或
[0016] (b)与SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的碱基序列具有至少70%的同源性的碱 基序列；或
[0017] (c)能与SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
[0018] 优选的，所述核酸序列包括SEQ ID NO. 1第1~1086位所示的核酸序列中1~90 个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在Y和/或:V端添加60个以内核苷酸形成的碱 基序列。
[0019] 第三方面，本发明提供一对用于扩增所述基因的核酸序列的CDNA的引物对，所述 引物对的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。
[0020] 第四方面，本发明还提供一种所述基因的核酸序列的启动子，所述启动子包括SEQ ID NO. 3所示的碱基序列。
[0021] 在本发明中，"分离的DNA"、"纯化的DNA"是指，该DNA或片段已从天然状态下位 于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0022] 在本发明中，术语"SmGMP蛋白编码序列"指编码具有茄子SmGMP蛋白活性的多肽 的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示的第1~1086位核苷酸序列及其简并序列。该简并序 列是指，位于SEQ ID NO. 1所示的第1~1086位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相 同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1 所示的第1~1086位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的 核苷酸序列。
[0023] 该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmGMP相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1所 示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~90个核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0024] 在本发明中，术语"SmGMP蛋白"指具有茄子SmGMP蛋白活性的SEQ ID NO. 2所示 序列的多肽。该术语还包括具有与茄子SmGMP蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异 形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能 相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括茄子SmGMP蛋白 的活性片段和活性衍生物。
[0025] 本发明的茄子SmGMP蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异 体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与茄子SmGMP相关DNA杂交的DNA 所编码的蛋白、以及利用茄子SmGMP蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0026] 在本发明中，"茄子SmGMP保守性变异多肽"指与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列 相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异 多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0027] 表1
[0030] 本发明还包括茄子SmGMP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与茄子SmGMP相关多 肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼
[0028]
[0029] 而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如 通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的 技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具 有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并 不限于上述列举的代表性的多肽。
[0031] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0032] 在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmGMP基因产物的表达模式， 即分析茄子SmGMP基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
[0033] 此外，根据本发明的茄子SmGMP核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或 表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmGMP相关同源基因或同源蛋白。
[0034] 为了得到与茄子SmGMP相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这 些探针是在低严谨条件下，用32P对茄子SmGMP相关的全部或部分做放射活性标记而得的。 适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库 的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购 自Clontech, Stratagene, Palo Alto, Cal.。这种筛选方法可以识别与前子SmGMP相关的基 因家族的核苷酸序列。
[0035] 本发明的茄子SmGMP相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组 法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其 是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法 所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次 PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0036] 当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其 克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0037] 此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0038] 除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽 而加以生产（Stewart 等人，（1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.，San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自 动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City，CA)来自动 合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的 分子。
【附图说明】
[0039] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0040] 图1为本发明的茄子GMP基因与番茄GMP基因 mRNA的同源比较（GAP)结果；
[0041] 图2为本发明的茄子GMP蛋白与番茄GMP蛋白的氨基酸序列同源比较（FASTA)结 果；其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；
[0042] 图3为本发明的茄子GMP基因在不同组织的表达情况；
[0043] 图4为本发明的前子GMP基因在低温下不同处理时间的表达情况。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通